【摘 要】
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本研究通过构建番茄蔗糖磷酸合成酶反义表达载体,用农杆菌介导法转化番茄植株,得到的主要研究结果如下:1.将保存在pMD18-T载体上的番茄蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段用HincⅡ和
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本研究通过构建番茄蔗糖磷酸合成酶反义表达载体,用农杆菌介导法转化番茄植株,得到的主要研究结果如下:1.将保存在pMD18-T载体上的番茄蔗糖磷酸合成酶基因cDNA片段用HincⅡ和XbaI进行双酶切,酶切产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒回收约830 bp的片段,即目的基因TSPS。经HincⅡ、XbaI酶切得到目的基因TSPS片段和经XbaI、SmaI酶切得到的质粒pROK3用T4DNA连接酶连接后,用热激法转化大肠杆菌DH5α,转化得到的阳性菌落经PCR扩增和酶切鉴定,都得到大小约为830 bp的片段,与目的片段大小吻合,说明番茄蔗糖磷酸合成酶基因片段TSPS已反向连接到植物表达载体pROK3上,构建了反义表达载体Anti-TSPS。2.通过番茄遗传转化体系的优化试验,确定番茄自交系中杂9号的最佳分化培养基为MS+ZT 2.0mg/L,最佳生根培养基为1/2 MS+IBA 0.5mg/L。再生苗经过培养室内炼苗一周左右直接定植田间,可以充分保证其成活率。3.利用农杆菌介导法转化番茄子叶,共获得135株番茄再生植株。用CTAB法分组提取叶片DNA进行PCR检测,有两组扩增到目的条带,大小为830 bp。然后分别对这两组单株提DNA鉴定共得到2株转化植株,对这两棵转化苗进行PCR-Southern blot分析,扩增到的目的片段均有杂交信号,说明Anti-TSPS基因已经整合到番茄植株中,排除了假阳性的可能,且在番茄植株中的转化率为1.4%。4.通过对转基因番茄成熟期果实糖酸组分及SPS酶活性的测定可以看出,转基因番茄果实酶活性显著下降,糖酸组分含量都较对照偏低,说明反义SPS基因对蔗糖代谢及积累具有调控作用。
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