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背景和目的伴随经济水平的逐步提高,饮酒的人越来越多,酒精性股骨头坏死(alcohol-induced osteonecrosis of the femoral head,AONFH)也成为骨科常见疾病之一,并有逐年增加的趋势。在未经有效治疗者中约80%将发生股骨头塌陷,关节功能受损毁坏,有极高的致残率,严重威胁着人类的健康和生活,此时保守治疗也已失去临床意义,因此预防酒精性股骨头坏死的发生突显重要。目前,有多种关于股骨头坏死的发病机理,如微血管损伤学说、股骨头内脂肪栓塞学说、股骨头内高压导致静脉瘀滞学说、全身或局部高凝低纤溶学说以及骨质疏松学说等等。经过大量深入研究,发现实验动物在酒精的影响下,不仅其股骨头细胞内成骨基因表达明显降低,成脂基因表达明显增高;而且其骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMCSs)成脂分化和抑制其成骨分化,引起股骨头内脂肪沉积,内压升高,血供减少,最后造成股骨头缺血坏死。作为一种诱导脂肪细胞分化的特异性转录因子,过氧化物酶体增殖子活化受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPARγ)在脂肪分化中表达,但在前脂肪细胞中不表达,并比大多数脂肪基因先表达,前脂肪细胞在没有PPARγ时很难分化为脂肪细胞。综上可推测,如果PPARγ基因表达被阻断,那么MBSCs在酒精诱导下成脂分化过程就可以被阻止;从而早期酒精性股骨头坏死的有效预防也成为可能。本研究拟将构建的mi R-548d-5p片段电转入大鼠体外BMSCs中,靶向阻止BMSCs中的PPARγ基因表达,抑制BMSCs向脂肪细胞分化,从而在早期阻止酒精诱导BMSCs成脂分化的过程,即希望从酒精性股骨头坏死发病机理的初始关键环节上预防该疾病发生。材料与方法选取2月龄雄性大鼠处死后取骨髓,制备大鼠BMSCs。实验分4组,空白对照组:未作特殊处理的BMSCs;模型组:0.09mol/L酒精+BMSCs;无关序列组:0.09mol/L酒精+电转入无关序列的BMSCs;基因组:0.09mol/L酒精+电转入mi R-548d-5p的BMSCs。将制备的第2代BMSCs按分组条件处理后接种于6孔培养板中,并且按实验要求加入酒精,始终保持培养液中酒精浓度为0.09mol/L;而且,每次BMSCs换液时也要重新加入酒精,浓度仍为0.09mol/L。每天在倒置显微镜下观察骨髓间充质干细胞的形态及生长状况,并做好实验记录。在BMSCs被酒精诱导第3和7天,采用TaqMan RT-PCR方法和免疫细胞化学技术(immunocytochemistry,ICC)分别检测实验中各组BMSCs内PPARγm RNA、BMP-2 m RNA和Runx2 m RNA,以及相应蛋白表达量的变化。在BMSCs被酒精诱导第14天,用相应ELISA试剂盒检测BMSCs中甘油三酯(Triglyceride,TG)含量和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性;在BMSCs被酒精诱导第14天,将培养的BMSCs用油红O进行染色,并且计数脂肪细胞,最后做好实验记录。结果1 BMSCs中PPARγm RNA、BMP-2 m RNA及Runx2 m RNA及相应蛋白表达检测结果酒精诱导第3和7天,模型组和无关序列组PPARγmRNA呈高表达,与空白对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。基因组PPARγm RNA呈低表达,与模型组和无关序列组之间比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。酒精诱导第3和7天,模型组和无关序列组BMP-2 m RNA及Runx2 m RNA均呈低表达,与空白对照组比较,差异有统计学意义(P<0.05);而与空白对照组比较,基因组BMP-2m RNA及Runx2 m RNA的表达水平接近,差异无统计学意义(P>0.05)。免疫细胞化学技术检测蛋白表达结果显示:与模型组和无关序列组相比较,基因组和空白对照组中相关基因的蛋白表达明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。2 BMSCs的成骨分化碱性磷酸酶活性及成脂分化甘油三酯含量检测结果酒精诱导第14天检测细胞内碱性磷酸酶活性及甘油三酯含量,与空白对照组比较,模型组和无关序列组中碱性磷酸酶活性均降低、甘油三酯含量增高,差异有统计学意义(P<0.05);与空白对照组比较,基因组中碱性磷酸酶活性稍降低、甘油三酯含量接近,差异无统计学意义(P>0.05)。2 BMSCs成脂分化油红O染色和脂肪细胞计数检测结果酒精诱导第14天油红O染色后脂肪细胞计数检测结果表明,与空白对照组比较,模型组和无关序列组脂肪细胞计数均升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。与模型组和无关序列组两组相比较,基因组脂肪细胞计数明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05);但是和空白对照组相近,差异无统计学意义(P>0.05)。结论1.体外大鼠BMSCs实验结果可以证明:mi R-548d-5p可以有效阻断酒精诱导BMSCs内PPARγm RNA的表达,抑制其成脂分化并维持成骨分化。2.利用mi R-548d-5p阻断BMSCs内PPARγ基因表达的细胞学实验,有望为预防或治疗酒精性ONFH的发生提供新的思路和科学依据。