目的:多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)是一种具有广泛基因异质性的疾病,其发生机制除了要经历免疫球蛋白重链基因重排以外,还要经历体细胞高频突变,其中主要突变包括KRAS、NRS、BR4F等基因突变,这些突变可能与MM克隆演变、细胞耐药与预后密切相关。本研究目的主要包括:1.探究KRAS、NRAS、BRAF基因突变在MM患者中的表达情况及这些基因突变是否与MM不良预后相关。2.探究数字微滴 PCR(droplet digital polymerase chain reaction,ddPCR)方法检测上述基因突变的可行性,以及采用该手段检测外周血循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)基因突变与骨髓样本检出率的一致性。3.探究泛Raf抑制剂LY3009120抗MM细胞增殖的作用机制。方法:1.ddPCR方法检测MM患者KRAS、NRAS、BRAF基因突变情况:以天津医科大学肿瘤医院血液科2010年至2016年收治的85例初诊MM患者为研究对象,与患者签署知情同意书后,提取骨髓单个核细胞、骨髓浆、外周血ctDNA,采用ddPCR的方法检测BR4F V600E,BRAF Mx,KRAS G12/G13,NRASG12/G13和NRASQ61的突变情况,并比较3种样本的突变检出一致率,对该组MM患者生存进行统计学分析,探究这些基因突变对其预后的影响。2.MTT法检测LY3009120对MM细胞增殖活性的影响:以3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象,用不同浓度梯度的泛Raf抑制剂LY3009120孵育MM细胞24 h、48h、72h后,采用MTT比色法检测细胞增殖活力的变化。3.流式细胞术检测细胞周期变化及细胞凋亡情况:以3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象,以不同浓度LY3009120处理后,采用PI染色法检测细胞周期是否有变化、细胞是否出现凋亡。4.Western Blot法检测MM细胞RAF、MEK、ERK蛋白的表达情况:以3种MM细胞株LP-1(RAS基因野生型)、U266(BRAF基因突变)、RPMI8226(KKRS基因突变)为研究对象,采用Western Blot的方法检测RAF、MEK、ERK蛋白的表达水平。5.Westerm Blot法检测细胞信号通路:以3种MM细胞株LP-1、U266、RPMI8226为研究对象,以LY3009120处理后,采用Western Blot方法检测其是否通过PI3K/Akt信号通路发挥生长抑制作用。6.实验中所有数据均使用SPSS statistics21.0统计软件进行统计学分析,生存分析采Kaplan-Meier法,P<0.05为差异具有统计学差异。实验结果相关作图采用GraphPad Prism 5进行图形分析。结果:1.85例MM患者进行了骨髓单个核ddPCR检测:共30人检测出基因突变,检出率为35.3%,其中BRFMx突变4例(5%),该4例患者均证实为V60E突变Mx突变 Mx15 例(18%),NRASG12/G13 突变 3 例(4%)NRAS,Q61突变15例(18%)。20例患者同时收集了外周血ctDNA并进行ddPCR检测:其中BRAF Mx突变7例(35%),这7例患者中有3例证实是V600E突变;KRAS Mx突变2例(10%),NRAS G12/G13突变0例,NRAS Q61突变4例(20%)。13例患者骨髓液离心后收取骨髓浆,提取ctDNA后行ddPCR检测:其中BRAF Mx突变1例(8%),该例患者证实是V600E突变;KR4S Mx突变0例,NRASG12/G13突变0例,NRAS0例,突变1例(8%)。骨髓单个核、骨髓浆、血浆基因突变检出一致率在70%以上。2.多数患者突变为亚克隆,共59例患者可纳入生存分析,有上述任一基因突变者总生存(overall survival,OS)明显短于无突变患者,但未达统计学差异(25个月Vs 61个月,P=0.767),同时存在2个以上突变的患者OS并无明显缩短。其中有NRAS(包括G12/G13和Q61)突变的患者OS显著短于无NRAS突变的患者,但未达统计学差异(19个月Vs61个月,P=0.0526);KRASMx突变患者OS短于无KRAS Mx突变者,但未达统计学差异(19个月Vs 59个月,P=0.7933);BR4F突变(包括BRAFMx和V600E)患者OS与无突变患者亦无统计学差异(59个月Vs 61个月,P=0.8)。3.能够统计等位基因突变频率(variant allelic frequency,VAF)的患者一共46例,其VAF中位值为1.4%(范围0.13%-34%),高VAF突变率患者OS短于低VAF突变率患者,但未达统计学差异(24个月Vs 56个月,P=0.38)。4.MTT 实验结果得出:LY3009120 对 3 种 MM 细胞株 LP-1、U266、RPMI8226均具有生长抑制作用,并且随着药物浓度的增加,抑制作用逐渐增强(P<0.05),随着药物作用时间的增加,抑制作用亦逐渐增强(P<0.05)。三种细胞株IC50分别为 1.5uM、0.2uM、5uM。5.流式细胞术测细胞周期实验得出:与对照组相比,LY3009120组在G1期细胞比例增高,提示肿瘤细胞被阻滞在G1期。6.流式细胞术测细胞凋亡实验得出:以1uM、10uM、20uM浓度的LY3009120处理3种细胞株后,24h、48h、72h均可观察到细胞凋亡,且随着药物浓度的增加及药物作用时间的延长,凋亡现象逐渐增强(P<0.05)。7.Western Blot实验得出:MM细胞株中普遍中等到高强度表达RAF、p-MEK1,2/ERK1,2蛋白,RAS野生型与突变型细胞株之间的表达无差异。8.Western Blot实验得出:用LY3009120处理MM细胞系后,细胞周期调控蛋白P21表达水平上调,凋亡相关蛋白SMAC表达上调,RAF、p-MEK1,2/ERK1,2表达水平下调,P-Akt表达水平下调。结论:1.采用ddPCR技术检测MM患者基因突变敏感性高,可行性强;有RAF、RA基因突变的患者其OS要短于无突变患者,高VAF患者OS亦短于低VAF患者;ddPCR检测患者外周血ctDNA与骨髓单个核一致率较高,提示采用外周血检测患者基因突变的方法在临床上可行,或可作为MM患者临床预后评价的新指标。2.MM细胞株普遍高表达RAF、MEK1,2/ERK1,2蛋白,泛Raf抑制剂LY3009120对MM细胞株具有明显的杀伤作用,主要表现在生长抑制作用和促凋亡作用增强,其可能通过PI3K/Akt信号通路发挥作用,且该药对MM的杀伤作用与RAS、RAF基因突变无关,或可为有RAS、RAF基因突变的MM患者提供一个新的治疗思路。目的:近年来,环状RNA(circularRNAs,circRNA)作为一种非编码RNA可以多种方式参与表达与调控,尤其在肿瘤的发生发展中所产生的作用亦逐渐被发现。而关于多发性骨髓瘤(multiplemyeloma,MM)中circRNA的表达和作用目前国内外尚无报道,因此本研究主要目的包括以下几个方面:1.检测MM患者circRNA表达谱,分析MM差异表达circRNA2.GO(Gene Ontology)分析、KEGG 分析构建 circRNA-microRNA 网络体系方法:1.MM患者和健康对照者骨髓单个核细胞提取:选取天津医科大学肿瘤医院血液科收治的MM患者12例,正常干细胞移植供者8例,与受试者签订知青同意书后,抽取受试者骨髓,采用Ficoll密度梯度离心的方法提取受试者骨髓单个核,MM患者骨髓单个核再采用CD138磁珠进行分选,最终得到纯化的骨髓瘤细胞,-80℃保存备用。2.RNA文库的制备:采用Trizol法抽提上述两组单个核细胞RNA,总RNA质控后,采用Ribo-Zero rRNARemoval Kits试剂盒去除核糖体RNA(rRNA),然后采用TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit 试剂盒进行 RNA 文库制备。3.反转录合成cDNA并上机测序:将上述 RNA 采用 TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Kit 试剂盒合成cDNA,添加引物接头后,在Illumina HiSeq测序仪上采用双端模式(PE mode)进行150 cycle测序。4.circRNA表达谱分析及差异circRNA鉴定:与经典转录本相比,环状RNA以环状剪接为主要特征。剪接reads的彻底鉴定促进了环状RNA丰度的准确评估。我们以比对到的剪接reads数作为环状RNA的表达水平。利用标准化的reads数,计算两组样品间的差异表达环状RNA。计算倍数变化(fold change)和P值,以倍数变化>=2.0,P<0.05作为差异环状RNA的阈值。将分析出的差异circRNA通过qPCR的方法在MM样本中进行验证。5.差异circRNA来源基因GO分析:通过http://www.geneontology.org分析差异circRNA来源基因,包括以下三个方面:分子功能(Molecular Function,MF)、生物过程(Biological Process,BP)和细胞组分(Cell Component,CC)。P<0.05被认为具有统计学差异。6.差异circRNA来源基因KEGG信号通路分析:KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上,以进行这些分子的生物学功能解释的过程。通过差异表达环状RNA来源基因的通路分析能够推断它们参与的通路,并推断它们的生物学功能。以P<0.05作为显著富集的阈值。7.circRNA与microRNA相互关系预测:最新证据己经证明环状RNA通过吸收miRNA,精细调节miRNA水平,即作为”miRNA海绵“(miRNA sponge)执行功能。为了探索环状RNA的功能作用,通过流行的miRNA 基因预测软件进行差异环状RNA-miRNA相互作用预测,以推断可以作为”miRNA海绵“的环状RNA。从预测的环状RNA-miRNA列表中,以具有该miRNA结合位点的环状RNA及其预测的miRNA位点为数据,使用cytoscape软件构建了环状RNA-miRNA网络图,以展示它们之间的相互作用。结果:1.差异circRNA谱分析:以倍数变化>=2.0,P<0.05作为差异环状RNA的阈值,MM组与正常供者组差异circRNA共105个,其中上调circRNA共84个,下调circRNA共21个。2.差异circRNA来源基因GO分析:在MM患者中上调的circRNA基因来源最多富集的GO条目包括肽基氨基酸的修饰(peptidyl-amino acid modification)、细胞膜上细胞器功能相关(intracellular membrane-bounded organelle)以及组蛋白赖氨酸的甲基转移酶活化(histone-lysine N-methyltransferase activity)等方面;在MM患者中下调的circRNA基因来源最多富集的GO条目包括细胞活化相关(cellactivation)、细胞质相关(cytoplasmicpart)以及细胞骨架蛋白结合相关(cytoskeletal protein binding)等方面内容。3.差异circRNA来源基因KEGG分析:在MM患者中上调的circRNA基因来源主要参与的信号通路包括癌症转录调控(Transcriptional misregulation in cancer)、内质网蛋白加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)等;在MM患者中下调的circRNA基因来源主要参与的信号通路包括胆碱代谢(Choline metabolism in cancer)、磷脂酶 D 信号通路(Phospholipase D signaling pathway)等。4.差异circRNA与microRNA相互关系预测:我们筛选了 5个在MM患者中高表达的circRNA,并分析了与其相关的microRNA,主要包括miR-892、miR-608、miR-520、miR-17-3p、miR-103、miR-270 等。结论:MM患者circRNA表达与正常对照者有显著差异,提示circRNA或可以作为MM新的生物学标记(biomarker),circRNA与MM疾病发展与预后的关系有待进一步的深入研究。