氧化应激对RPE细胞αB-晶状体蛋白表达的影响

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目的探讨氧化应激对视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞αB-晶状体蛋白(CRYAB)表达的影响。方法(1)用不同浓度的H2O2处理RPE细胞,用MTT方法检测细胞活性,选出对细胞存活率影响无统计学差异的H2O2处理条件,将RPE细胞按照H2O2处理时间分组:1h组、3h组、6h组;每组各用不同浓度H2O2(空白对照、100μmol/L、200μmol/L、300μmol/L)处理。用Western Blot、RT-PCR法分别检测RPE细胞CRYAB的蛋白及基因表达。(2)用荧光标记的阴性siRNA和lipofectamin2000试剂按照不同浓度比例转染RPE细胞,选出最优转染条件进行后续实验。设计3条CRYAB的干扰RNA,选出沉默效果最佳者。(3)设置siRNA组、siRNA+H2O2组、阴性siRNA对照组(NC组)、H2O2组、空白对照组;转染时间为24h,200μmol/L的H2O2处理6h;用RT-PCR、Western Blot法分别检测RPE细胞CRYAB的基因及蛋白表达。结果(1)1h组H2O2浓度在100μmol/L时CRYAB的基因表达增加趋势明显(P<0.05),但CRYAB的蛋白增加并不明显(P>0.05);在1h组(H2O2浓度为200μmol/L、300μmol/L时)、3h组和6h组,随着H2O2浓度增加CRYAB的基因与蛋白表达都有明显增加,且差异有统计学意义(P<0.05);在相同浓度H2O2刺激下CRYAB的基因和蛋白表达量随时间延长而增高,且差异有统计学意义(P<0.05)。(2)siRNA与Lipofectamine2000的比例在1:0.019,且siRNA浓度在105nM时转染效果最佳。(3)H2O2组与空白对照组、siRNA+H2O2组相比CRYAB的基因与蛋白表达均增高,差异有统计学意义(P<0.05);siRNA组与siRNA+H2O2组、空白对照组相比CRYAB的基因与蛋白表达均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论(1)RPE细胞CRYAB的表达呈H2O2剂量依赖性和时间依赖性;(2)设计的SiRNA-CRYAB-464能有效沉默RPE细胞CRYAB基因;(3)RPE细胞CRYAB基因沉默后,有效减少低剂量短时间(200μmol/L H2O2,6h)的氧化刺激后RPE细胞CRYAB的基因和蛋白的高表达。
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