乐果（Dimethoate,DMT）(分子式:C5H12NO3PS2)是一种用途广、产量大、易挥发且具有内吸性的有机磷杀虫剂、杀螨剂,其具有潜在致癌、致畸和致突变作用,主要用于防治桑瘿蚊、桑尺蠖等。研究表明,乐果被认定为一种环境激素,很低剂量的情况下也会干扰动物的生长发育、繁殖或激素的合成代谢。乐果能影响动物全身脏器,并能抑制中枢神经系统和呼吸中枢系统,导致呼吸衰竭严重致死。乐果进入动物体内后能迅速降解为氧化乐果（OMT）,造成神经生理功能紊乱,严重影响动物健康,并且降解速度较慢。值得注意的是,乐果对动物的毒性已有了大量的研究报道比如狼蛛、蜗牛、鲤鱼、小鼠等。然而,有关乐果对昆虫等无脊椎动物的生殖影响方面却未见报道。家蚕（Bombyx mori）是一种重要的鳞翅目经济昆虫,现已成为重要的模式生物,广泛用作细胞生物学、生理学、医学和毒理学等领域。在长期的人工驯化过程中,家蚕的抗逆能力逐渐下降,对外界刺激物的耐受力减弱,因此,有机磷农药对家蚕生殖毒性成为近年来的研究热点之一。污染物体内毒性检测的方法包括宏观的和微观的。目前乐果对家蚕的毒性安全评价研究较少,并对家蚕的生活史特征的影响更是鲜有报道,本研究选取广泛用于生产的品种872×871家蚕为研究对象,研究农药乐果对无脊椎动物家蚕的生殖毒性,采用经口添食乐果的方法和体外离体培养相结合,取五龄第五天家蚕生殖腺组织为研究材料。利用组织切片技术、ELISA、RT-qPCR、高通量测序等技术从生理生化和分子角度分析乐果对家蚕生殖发育的影响,从而探讨乐果胁迫下对家蚕子代的影响。利用多项分子生态毒理学指标进行评价,可以为家蚕生殖毒理学提供更多的信息和更可靠的依据能更好地对生物体污染情况进行科学的预报,也能更准确地揭示环境污染物的毒害机理。通过本研究也为大田喷洒有机磷乐果农药污染间作桑园可能影响家蚕正常发育的安全性评估提供试验依据。本研究的主要结果如下:1.农药乐果对家蚕的生长发育毒性乐果（DMT,40%乳油,重庆市化工集团）用纯水配成800 mg/L母液备用。并分别稀释为50,100,200 mg/L的溶液,采用―浸叶法‖浸泡桑叶1 min饲喂家蚕作为实验组,添食清水浸泡过的桑叶作为对照组。调查家蚕872×871品种的结茧率、化蛹率、全茧量、茧层率、造卵数、受精率、子代孵化率以及幼虫期生殖腺指数,与对照组相比都出现明显的下降。家蚕通过添食含乐果桑叶,家蚕精巢、卵巢组织中会有乐果残留的累积,并且累积量伴随着胁迫浓度与胁迫时间的增加而增多。2.农药乐果对家蚕生殖腺组织和子代蚕卵的病理损伤利用组织切片技术和生精囊体外培养技术研究发现乐果胁迫对雄性家蚕幼虫生殖腺造成严重影响,导致生殖腺组织的形态结构发生了变化。研究发现对照组中性腺外膜中细胞结构完整,精巢内膜向内延伸形成3片隔膜,将精巢分成4个较为均一的精巢胞,每个精巢胞中细胞排列整齐,各精巢胞间的界限比较明显,精巢以次级精母细胞和精细胞为主,细胞排列整齐,细胞之间的界限很明显,且有精子束的出现。较于对照组,添加乐果的性腺发育明显滞后,精巢及各睾丸胞的体积逐渐变小,形态发生了明显变化,睾丸外膜变稀疏,现多空隙,且有破损,高浓度处理的精子束出现畸变,精细胞数目减少,部分细胞解体,腔内出现碎片,结构损伤严重,结构模糊。通过组织切片技术研究发现雌性家蚕对照组卵巢中的卵细胞排列较整齐,且分布均匀。而乐果实验组的卵巢形态发生明显变化,外膜出现空泡或凹陷,卵细胞分布不均且卵细胞较少且随着乐果浓度的增大,卵巢中细胞数目出现相对减少,细胞间出现空泡。蚕卵病理学检测发现实验组较对照组胚子发育较缓慢。3.农药乐果胁迫对家蚕氧化活性应激及生殖相关基因的影响CAT酶能迅速分解细胞代谢中产生的H2O2,从而清除自由基,SOD酶和CAT酶构成了应对外界胁迫的第一道防线,CAT酶是清除H2O2的主要酶,因此测定CAT、SOD的酶活性以及H2O2含量变化是了解机体自由基清除能力的重要手段之一。添食乐果后,实验组家蚕幼虫生殖腺中SOD、CAT酶活力相比对照组都呈显著性的下降趋势,体现了SOD和CAT作为保护酶系统成员的协同性。与对照组相比,实验组的雌、雄家蚕生殖腺中的H2O2含量表现较为相似,随乐果浓度的增加逐渐升高,但在50 mg/L实验组中出现下降趋势。但对比雌、雄家蚕生殖腺sod、cat基因m RNA水平的表达结果表明,农药乐果胁迫对家蚕雄性sod基因的m RNA水平较雌性影响更大。而cat基因m RNA水平在200 mg/L的浓度处理下,雌蚕表现为极显著性上调,而雄蚕则表现极显著下调,与生殖腺中sod基因的m RNA水平受农药乐果胁迫后完全抑制不同,一定浓度的乐果胁迫下,在生殖腺中CAT酶活性激活系统受到影响时,能够动员基因水平的表达,产生新的酶蛋白以缓解乐果胁迫对生殖细胞的危害。在本实验中的表现是生殖腺对农药乐果的毒害抵抗性弱,在乐果实验组酶活性和sod基因在m RNA水平的表达都呈下降趋势,可能没有足够能力及时清除农药乐果胁迫产生的超氧阴离子,进而损伤组织和细胞,影响家蚕的正常生理活动。通过qRT-PCR的方法,检测了家蚕幼虫期卵巢和精巢中生殖发育相关基因转录水平的表达。研究卵巢发育营养代谢相关基因（Ovo、Ovo-498、Ovo-781、Vg）、自我剪切调控基因（Sxl-L、Sxl-S）、与精巢发育的能量代谢和配子分化相关基因（Achi-L、Aly、Vlg）在乐果胁迫条件下的表达变化,Ovo、Ovo-498、Ovo-781、Vg、Sxl-L和Sxl-S基因的m RNA表达量均呈现下降趋势,而Achi-L、Aly、Vlg在精巢中出现下调表达。结果表明,乐果处理后,家蚕性腺中生殖发育相关基因的转录表达下调,推测可能对家蚕生殖能力有一定的影响。4.乐果对蚕卵基因表达谱分析为了进一步从分子机制研究乐果对家蚕生殖毒性的影响,我们利用RNA-Seq技术对乐果胁迫后家蚕蚕卵进行转录组分析。通过DGEs分析,200 mg/L的乐果胁迫组与对照组相比较,共鉴定出320个差异基因,其中211个上调表达,109个下调表达。对所有差异基因进行GO功能分类和KEGG信号通路分析,以确定它们的生物学功能和相关过程,结果表明,许多差异表达的基因参与海藻糖转运、应激反应、锌指蛋白、表皮蛋白的合成以及参与5-羟色胺通路。q RT-PCR分析证实了RNA-Seq结果的可靠性。结果表明:农药乐果的施用,对蚕卵的生长和发育具有实质性的影响,其中涉及多重代谢途径和相关的生物学功能。