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种子衰老是一个不可避免的过程,最终导致种子活力降低甚至丧失。研究并阐明种子衰老的机理,对种子的遗传改良以及开发种子的有效储藏技术具有重要意义。本研究以玉米杂交种“郑单958”为实验材料,分别进行人工老化（高温:45℃,高湿:100%的相对湿度）和自然老化处理,选取不同人工老化处理时间（0-5天）和自然老化处理3年的种子材料,测定种子的发芽率及种胚中MDA含量、H2O2含量和O2·-产生速率的变化,利用iTRAQ技术研究人工老化处理3天和自然老化处理3年后种胚蛋白质组的变化,筛选差异蛋白并利用生物信息学等方法分析差异蛋白的功能,采用荧光定量PCR技术对部分差异蛋白从m RNA水平上进行验证并分析其在不同老化时间内的表达模式,以期为揭示种子衰老的分子机制提供科学依据。结果如下:（1）在自然或人工老化条件下,随着老化时间的延长,种子发芽率逐渐降低。（2）随着老化时间的延长,种胚中MDA含量增加,种胚细胞膜脂氧化加剧,膜系统损伤加重。（3）老化过程中种胚中的H2O2含量和O2·-的产生速率表现为先增加后降低的趋势,处理3天时达到峰值,ROS在种子老化初期大量产生和积累。（4）iTRAQ结果分析表明,在人工老化和自然老化条件下分别筛选得到209和318个差异蛋白,其中79个相同。差异蛋白的功能涉及能量代谢、蛋白质周转、胁迫与防御、代谢、信号转导、膜与转运、转录及细胞生长/分裂等。利用KEGG数据库进行Pathway显著富集结果显示,人工老化过程中差异表达蛋白参与了138条代谢途径,其中14条通路得到富集,差异蛋白主要参与代谢、次生代谢产物的生物合成、内质网中的蛋白质加工、淀粉和蔗糖代谢等途径。自然老化过程中的差异表达蛋白参与了140条代谢途径,其中21条通路得到富集,差异蛋白主要参与代谢、次生代谢产物的生物合成途径、丙酮酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢以及糖酵解/糖异生等途径。表明老化处理造成细胞内的物质代谢和生理调控等过程异常,导致细胞正常功能受到损伤。人工老化和自然老化过程涉及的相关差异蛋白存在较大差异:能量代谢方面,人工老化过程中乙醇脱氢酶（tr|B6T5H2）、异柠檬酸脱氢酶（tr|B4FN97）和苹果酸脱氢酶（tr|B6SHX1）等下调表达;自然老化过程中果糖激酶（tr|B6TB39）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（tr|B6TDF8）、丙酮酸激酶（tr|B4FYH2）、二氢硫辛酸脱氢酶（tr|C0PHH5）和苹果酸脱氢酶（tr|O50015）等下调表达。表明老化过程中种胚细胞内糖酵解途径和三羧酸循环等能量代谢途径受到抑制。蛋白质周转方面,人工老化过程中核糖体蛋白（tr|B4FFZ6等）、翻译起始因子（tr|K7VAS4等）、分子伴侣cpn60家族蛋白（tr|B4FBP0）、蛋白质二硫键异构酶（tr|C0PLF0和tr|Q5EUD5）以及蛋白酶体亚基（tr|B6TAJ3）等发生差异表达;自然老化过程中,核糖体蛋白（tr|B4FFZ6等）、翻译起始因子（tr|C0P7L2）、分子伴侣cpn60家族蛋白（sp|P29185等）、肽酰脯氨酰顺反异构酶（tr|K7UIS1和tr|B6TI78）和泛素羧基末端水解酶（tr|C0P3H1）等发生差异表达。以上结果导致蛋白质合成能力下降且错误折叠蛋白增多。防御体系方面,人工老化过程中,谷胱甘肽转移酶（tr|O24595和tr|B6TLM5）、硫氧还蛋白（tr|Q4W1F6）、氧化还原酶（tr|B6TWC0）、多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（tr|B6TDD0）和核糖体失活蛋白（tr|Q2XXG4）等发生差异表达;自然老化过程中,过氧化物酶蛋白（tr|B6SJB3等）、谷氧还蛋白（tr|B6THA1和tr|B6SN61）、抗菌肽（tr|B6SKP5）和茉莉酸诱导蛋白（tr|B6SJJ4）等发生差异表达。大量胁迫与防御蛋白在种子老化过程中下调表达,造成细胞内防御系统紊乱。其他相关代谢方面,人工老化过程中天冬氨酸转氨酶（tr|B4FUH2）、丝氨酸羟甲基转移酶（tr|B6T7Q7）、磷酸戊糖焦磷酸激酶（tr|B6SK13）、咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶（tr|K7U827）和法尼基焦磷酸合酶（tr|Q548K3）等发生差异表达;自然老化过程中甲硫核糖激酶（tr|B6TDT6）、蛋氨酸S-甲基转移酶（sp|Q8W519）、异胡豆苷合成酶（tr|B6TY34）和细胞色素P450家族蛋白（tr|C0PH19）等发生表达。以上结果表明种子老化过程中氨基酸、核苷酸以及次生代谢产物的合成受到影响,细胞正常的物质代谢受到干扰。（5）分别选取12个衰老相关差异表达蛋白,qRT-PCR定量分析结果发现在人工老化和自然老化处理后分别有10个和8个蛋白的基因在m RNA水平与蛋白水平表达趋势相同,这些差异表达蛋白在老化过程中参与了能量代谢、蛋白质的翻译和活性氧清除等代谢途径和生理生化过程,可能在种子活力丧失过程中扮演重要角色。（6）根据以上结果和分析,本研究提出种子衰老的可能机制:种子老化过程中细胞内能量代谢受到抑制导致能量供应短缺,不能维持细胞正常生命活动的能量供给。核糖体蛋白、翻译起始因子和分子伴侣蛋白下调表达,导致蛋白质合成能力下降,错误折叠蛋白增多。抗氧化蛋白以及多种抗逆相关蛋白下调表达,导致细胞抗氧化能力下降和防御系统紊乱,相关代谢途径异常,造成种胚细胞活力下降甚至丧失,最终导致种子衰老直至死亡。