论文部分内容阅读
肿瘤微环境中的免疫应答往往处于被抑制状态,采用有效的手段恢复、激活肿瘤浸润免疫细胞的活性有助于抑制肿瘤的进展。本实验室前期工作阐明了白细胞介素-36γ(Interleukin-36γ,IL-36γ)能改善肿瘤免疫微环境、显著抑制肿瘤生长;但进一步的研究揭示了IL-36γ刺激的T细胞上调了免疫卡控点分子PD-1(Programmed death-1)的表达,可介导对肿瘤免应答的负反馈抑制作用。因此,IL-36γ刺激联合阻断PD-1信号可能有助于协同促进肿瘤免疫应答。本研究旨在通过制备共表达IL-36γ和可溶性PD-1(Solubel PD-1,sPD-1;PD-1分子的胞外段,可通过结合配体PD-L1等阻断PD-1信号)的基因转染细胞株、构建荷瘤小鼠模型,探讨IL-36γ刺激联合阻断PD-1信号对肿瘤免疫应答的协同促进作用和机制,为采用IL-36γ联合PD-1阻断型单抗应用于肿瘤临床治疗奠定理论基础。第一部分共表达IL-36γ和sPD-1基因转染细胞株的制备及其鉴定目的:建立稳定分泌IL-36γ和sPD-1的肿瘤细胞株,为实现IL-36γ和sPD-1在肿瘤微环境中的共表达、并进一步研究其对肿瘤免疫应答的协同促进作用奠定物质基础。方法:通过设计编码sPD-1的基因序列,将其插入质粒pCDEF3,并采用PCR和测序进行验证,构建能够转染表达sPD-1的质粒pCDEF3-sPD-1。将pCDEF3-sPD-1用脂质体转染B16细胞株;同时将其与含嘌呤霉素(puromycin)抗性基因的质粒p CMV4.Pur,用脂质体共转染之前已建立好的可稳定分泌IL-36γ的B16-IL-36γ细胞株;分别经G418或嘌呤霉素筛选和进行亚克隆处理,通过ELISA鉴定获得能稳定分泌sPD-1的细胞株B16-sPD-1和B16-IL-36γ-sPD-1,并对2种基因转染细胞株sPD-1的分泌表达水平进行比较分析。同时,采用空质粒进行转染获得对照组B16-vec。结果:通过设计能够表达sPD-1基因的序列和进行基因重组,并经验证,成功构建了pCDEF3-sPD-1重组表达载体。通过脂质体转染,经筛选、亚克隆和ELISA检测,成功获得一系列可稳定分泌表达sPD-1的B16-sPD-1和B16-IL-36γ-sPD-1克隆细胞,为实现IL-36γ和sPD-1在肿瘤微环境中的共表达、并为进一步研究其对肿瘤免疫应答的促进作用奠定了良好的物质基础。结论:成功构建了能稳定分泌sPD-1的B16-sPD-1和稳定共表达IL-36γ和sPD-1的B16-IL-36γ-sPD-1基因转染细胞株,为进一步研究IL-36γ刺激联合阻断PD-1信号对肿瘤免疫应答的促进作用和机制奠定了物质基础。第二部分IL-36γ联合阻断PD-1信号促进肿瘤免疫应答的研究目的:通过分别构建B16-vec、B16-sPD-1、B16-IL-36γ、B16-IL-36γ-sPD-1荷瘤小鼠模型,探讨分泌过表达于肿瘤微环境中的IL-36γ和sPD-1对肿瘤免疫应答的促进作用和机制,为采用IL-36γ联合阻断免疫卡控点分子PD-1应用于肿瘤临床治疗奠定理论基础。方法:通过流式细胞术检测小鼠肿瘤细胞株表面PD-L1的表达;通过QRT-PCR分析IL-36γ分别体、内外刺激的T细胞和肿瘤组织中PD-1的表达。将B16-vec、B16-sPD-1、B16-IL-36γ和B16-IL-36γ-sPD-1基因转染细胞分别接种于C57BL/6 WT小鼠的腹部皮下组织,每2天测量小鼠肿瘤生长并观察其生存期;在肿瘤生长的早期和晚期分别取小鼠肿瘤组织进行消化处理,采用流式细胞术检测小鼠肿瘤微环境中免疫细胞的分布和功能,并进行比较分析。结果:结果表明,B16细胞表面表达PD-L1;IL-36γ的刺激明显上调T细胞中PD-1基因的表达,同时在肿瘤中过表达IL-36γ导致肿瘤组织中PD-1明显上调。通过荷瘤小鼠模型,发现相较于IL-36γ刺激组,IL-36γ刺激联合sPD-1阻断PD-1信号,更加能够显著抑制小鼠肿瘤的生长,并极明显地延长荷瘤小鼠的生存期。对荷瘤小鼠早期肿瘤微环境中免疫细胞检测结果表明,IL-36γ刺激联合阻断PD-1能显著促进肿瘤免疫应答。与单纯的IL-36γ过表达组相比,IL-36γ联合sPD-1在肿瘤微环境中的共表达,能显著上调CD4+TILs的比例,促进CD4+和CD8+TILs核增殖抗原Ki67表达,下调CD11b+Gr-1+MDSCs的比例;对B16-IL-36γ和B16-IL-36γ-sPD-1晚期肿瘤微环境中免疫细胞检测结果表明,与单纯的IL-36γ过表达组相比,IL-36γ联合sPD-1在肿瘤微环境中的共表达,能显著增加CD45+细胞群体的比例,促进CD4+和CD8+TILs细胞核增殖抗原Ki67表达,增强CD4+和CD8+TILs的IFN-γ的表达水平。结论:IL-36γ刺激联合sPD-1阻断PD-1信号能极为显著地抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期,对对肿瘤免疫应答具有明显的促进作用。