【背景】铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)引起的生物膜(biofilm,BF)相关感染是临床常见的难治性感染。生物膜细菌对抗菌药物的抵抗力增加,又不易被机体内的抗体溶解和巨噬细胞吞噬,是造成持续感染的主要原因。据美国NIH最新的统计资料,人类60%以上的细菌性感染与生物膜相关。因此,探寻细菌生物膜形成及影响机制、生物膜细菌的耐药机制,对开发防治生物膜相关疾病的新方法、新技术具有重要意义。 【目的】(1)研究选择一种有效且简单易行的生物膜测量方法,并以此方法研究不同环境条件包括不同培养时间、孵育温度、黏附材料和液体流速下,铜绿假单胞菌生物膜形成的差别。(2)将复合生物酶对铜绿假单胞菌生物膜的降解作用与头孢他啶的杀菌活性相结合,通过生物酶破坏或清除生物膜,继而大大增强头孢他啶杀灭生物膜内细菌的能力,为有效治疗生物膜相关感染提供新方法。(3)针对铜绿假单胞菌生物膜的结构特点,比较不同β-内酰胺类抗生素对生物膜内铜绿假单胞菌ampC基因的诱导特性和差别,探讨铜绿假单胞菌生物膜的部分耐药机制。 【方法】(1)分别采用流动培养法和静止培养法建立生物膜模型。用4种不同的方法:共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)法、扫描电镜法、结晶紫染色法和超声振荡-活菌计数法分析生物膜的形成情况,确定一种简单有效的方法,并用其检测在流动培养状态下不同培养时间(8h、24h、72h)、不同温度(23℃、37℃)、不同粘附材料(玻璃、硅胶)、不同液体流速(30ml/h、90ml/h)和不同培养基(M63、MH、LB)生物膜内活细菌数。(2)采用改良Robbins装置建立不同培养时间铜绿假单胞菌生物膜,分别浸泡入含和不含复合生物酶的培养基中,观察复合生物酶对不同培养时间生物膜的清除作用。另外,在4个改良Robbins装置上建立48h生物膜,采用4种溶液灌注Robbins装置24h,观察复合生物酶对头孢他啶杀菌活性的增效作用。(3)培养72h PA01铜绿假单胞菌生物膜,暴露于浓度≥浮游菌MIC的β-内酰胺类抗生素(包括青霉素类、头孢菌素类、碳青霉烯类抗生素)7h后,提取细菌的RNA,进行反转录,用半定量和定量PCR的方法比较不同的β-内酰胺类抗生素作用下生物膜内铜绿假单胞菌mRNA表达量的改变。 【结果】(1)CLSM能够显示生物膜立体结构,及内部微菌落的密度和生物膜的厚度;扫描电镜法显示生物膜表面细菌的细微结构,及形状不规则的基质成分;结晶紫染色法可通过检测吸光度值,间接比较生物膜的形成情况。超声振荡-活菌计数法通过生