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目的CXC趋化因子受体4(CXC chemokine receptor-4,CXCR4)与肿瘤的增殖、粘附、侵袭及转移能力密切相关。本实验室前期研究发现CXCR4的表达与胆囊癌的增殖、侵袭成正相关,但机制不明。胆囊长期的慢性炎症刺激可促进胆囊癌的发生发展。推测炎症介质因子LPS(脂多糖)与胆囊癌细胞CXCR4的表达有关,目前有关研究未见报道。因此,本课题拟围绕两部分内容开展研究:1、LPS对胆囊癌细胞表达CXCR4的影响;2、LPS诱导胆囊癌细胞表达CXCR4分子机制。方法1、用LPS(50ng/ml)作用胆囊癌NOZ细胞和siNF-κBNOZ细胞,通过Western blotting检测CXCR4表达情况。2、通过DNA重组技术构建一系列含CXCR4启动子截短片段的萤火虫荧光素酶报告质粒,用双荧光素酶检测系统分析CXCR4启动子活性。3、应用软件TFbind、Promoter Scan对CXCR4启动子上潜在的NF-κB结合位点进行预测。4、通过碱基定点突变、电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)确定CXCR4基因启动子上的NF-κB结合位点及LPS对启动子活性的影响。5、应用RNAi沉默干扰技术检测CXCR4启动子活性。6、统计学分析方法:总体均数的比较采用t检验,显著性水平α=0.05,P<0.05为有统计学差异。结果1、LPS通过NF-κB促进胆囊癌细胞表达CXCR4。1)LPS作用胆囊癌NOZ细胞后,细胞CXCR4表达较对照组增强(0.998±0.10 vs 0.5977±0.17),差异有统计学意义(P<0.05);2)si-NF-κB组的CXCR4表达较LPS处理组明显减弱(0.3718±0.10 vs 0.998±0.10),差异有统计学意义(P<0.05);2、LPS促胆囊癌细胞CXCR4表达的分子机制。1)成功构建一系列含CXCR4启动子截短片段的重组质粒,双荧光素酶系统检测结果显示重组质粒PGL4-319较PGL4-131(2.32±0.04 vs 1.10±0.04)呈现出更强的荧光活性,差异有统计学意义(P<0.05),提示:-319至-131 nt这个区间可能存在调控CXCR4转录活性的调控位点。2)TFbind、Promoter Scan软件预测结果显示,CXCR4启动子转录起始位点ATG上游-319至-131 nt区间存在两个潜在的NF-κB结合位点:CAGCAGGGTCC(-319至-308nt)和CCTGGGCTTCCCAA(-307至-293nt);分别命名为NF-κB(1)、NF-κB(2)。3)定点诱变、电泳迁移率变动分析(EMSA)和染色质免疫沉淀(ChIP)实验证实转录因子NF-κB可直接与CXCR4启动子-319至-131nt区间的NF-κB位点结合,且LPS可以增强NF-κB与这个位点的结合。4)NF-κB位点突变对LPS诱导CXCR4启动子活性的影响:“PGL4-NF-κB mut1”(0.36±0.06)较对照质粒PGL4-319(0.61±0.07)荧光活性显著减弱,差异有统计学意义(P<0.05).“PGL4-NF-κB mut2”(0.61±0.16)较对照质粒PGL4-319荧光活性无明显减弱,差异没有统计学意义;表明LPS可通过突变1的NF-κB结合位点调控CXCR4的启动子活性,差异有统计学意义(P<0.05)。3、LPS通过NF-κB增强CXCR4启动子活性。1)沉默NF-κB对LPS诱导CXCR4启动子活性的影响:LPS诱导si NF-κB NOZ细胞的PGL4-319活性较NOZ细胞的弱(0.44±0.21 vs0.57±0.15),差异有统计学意义(P<0.05)。表明LPS通过NF-κB增强CXCR4启动子活性。结论1、CXCR4启动子-319至-131nt区间存在一个有活性的NF-κB结合位点,且LPS可增强NF-κB与这个位点的结合。