红细胞的体外制备为血液的医学研究提供了新的思路。传统的诱导方法有两种,拟胚体法和基质细胞共培养法。然而这两种方法存在步骤繁琐、诱导周期长、效率较低、含有动物源性物质的缺陷。本研究对以往的方法进行了改进,实现了红细胞的“两步法”诱导。首先将hiPS细胞和hUCMSC^Rh-A细胞贴壁培养,使其向中胚层方向分化,诱导为CD31⁺和CD34⁺细胞群。随后收集上一步的CD31⁺和CD34⁺细胞群,在特异造血因子的作用下使其向红细胞方向诱导分化。最终获得了hiPS来源的红细胞,通过吉姆萨染色和荧光定量PCR检测其大小形态与正常红细胞相似,且表达成熟的β-globin,而hUCMSC^Rh-A细胞来源的红细胞为未成熟的红细胞。采用Rh阴性的人脐带间充质干细胞为研究对象,是为了获取Rh阴性的红细胞,为体外制备Rh阴性O型的“万能血”提供了新的思路。本研究获得的主要结果如下:1.人多能干细胞的体外培养和鉴定hiPS细胞在体外培养的过程中,细胞克隆形态和增殖速度均正常,并未出现衰老和分化的迹象。通过细胞的免疫荧光法,对多能标记OCT4、SOX2以及NANOG进行了检测,结果显示这些多能标记在hiPS细胞中呈阳性。hUCMSC^Rh-A细胞在体外培养时,始终呈现梭形的形态,没有细胞分化和凋亡。利用RT-PCR法检测hUCMSC^Rh-A细胞多能基因的表达,结果发现其表达间充质干细胞标志的基因CD29、CD90和CD117,不表达CD31、CD34和CD45等与造血相关的基因。随后,采用细胞流式技术,检测hUCMSC^Rh-A细胞中多能标记的表达水平,结果发现其高表达CD44和CD71,低表达CD31、CD34和CD45等。2.人多能干细胞向CD31⁺和CD34⁺细胞群的诱导分化优化的“两步法”诱导,首先将hiPS细胞和hUCMSC^Rh-A细胞通过贴壁培养,诱导为CD31⁺和CD34⁺的细胞群。hiPS细胞经过6天的诱导,用细胞流式仪检测发现,hiPS细胞来源的CD31⁺和CD34⁺细胞群中,表达CD31的细胞占细胞总数的31.2%,表达CD34的细胞占细胞总数的8.2%。hUCMSC^Rh-A细胞经过10天的诱导,并用细胞流式仪和RT-PCR法检测收集的细胞。结果发现,第10天时hUCMSC^Rh-A细胞来源的CD31⁺和CD34⁺细胞群,其中表达CD31的细胞占细胞总数的5.3%,表达CD34的细胞占细胞总数的22.7%。第14天时hUCMSC^Rh-A细胞来源的CD31⁺和CD34⁺细胞群中,只有1.2%的分化细胞群体表达CD31,5.6%的分化细胞群体表达CD34,说明随着诱导的进行,表达CD31和CD34的细胞逐渐减少。3.CD31⁺和CD34⁺细胞群分化为红细胞“两步法”诱导的第二阶段是经过36天的持续悬浮诱导,将hiPS细胞来源的CD31⁺和CD34⁺细胞群诱导为红细胞。通过吉姆萨染色发现,诱导得到的红细胞已有脱核的现象,且其形态大小与人正常红细胞相似。采用qRT-PCR检测globin基因的表达水平,结果表明,γ-globin、ε-globin和β-globin三种基因的表达比例分别是74%、6%和20%。将诱导得到的红细胞进行2个小时的静置,获得了红色的细胞沉淀。然而,hUCMSC^Rh-A细胞来源的CD31⁺和CD34⁺细胞群,将其进行第二步诱导,但目前只能获得诱导分化为未成熟的红细胞。通过RT-PCR法检测globin基因的表达发现,诱导获得的未成熟红细胞不表达成熟红细胞中的β-globin,和未成熟的ε-globin,只表达未成熟的γ-globin。综上所述,本研究采用贴壁—悬浮“两步法”的诱导法,成功获得了类似造血祖细胞的的CD31⁺和CD34⁺细胞群(hiPS细胞和hUCMSC^Rh-A细胞来源)和有成熟β-globin表达的红细胞（hiPS细胞来源）。本研究优化了以往的诱导体系,为红细胞体外的大量制备提供了新的技术方法和研究思路。