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目的:增生性瘢痕(HS)是创面愈合后局限性瘢痕增生的一种病理现象,其病理本质是局部以成纤维细胞(Fb)为主的细胞成分的异常增殖及以胶原(collagen)为主的细胞外基质(ECM)的过度沉积。目前对其发病机制仍不是很清楚,一般认为其发生、发展是细胞、细胞因子和细胞外基质三者共同作用的结果。在此过程中,细胞因子是重要的信号分子,一方面细胞合成和分泌多种细胞因子;另一方面,细胞因子调节细胞的增殖、凋亡,控制着细胞外基质的合成和分泌,是瘢痕增生的关键性因素。
树突状表皮γδT细胞(DETCs)恒定表达于皮肤表皮,通过突触与周围的表皮细胞相联系,并通过自分泌与旁分泌的方式分泌多种细胞因子、生长因子,如角化生长因子1(KGF-1)、角化生长因子2(KGF-2)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、白介素2(IL-2)等,在维护上皮表面完整性中起重要作用。转化生长因子(TGF-β)是一种具有多种生物学效应的细胞因子,影响伤口愈合过程的所有阶段,包括炎症反应和细胞外基质积累,目前普遍认为它与病理性瘢痕形成有密切联系。本实验的目的在于观察DETCs在增生性瘢痕中的存在及其分泌的IGF-1介导的PI3K/Akt信号通路,在增生性瘢痕形成中的作用,为探索增生性瘢痕的发病机制提供新的科研思路。
方法:用于实验的组织标本均来自白求恩国际和平医院烧伤整形外科自愿接受瘢痕整复手术的病人,共8例,取材部位及周围无感染和溃疡,均无任何抗瘢痕性药物治疗,均无自身免疫系统及皮肤等疾病。取材前向病人说明取材目的,病人表示同意。实验分2组:增生性瘢痕(HS)组和正常皮肤(NS)组,HS组包括男性4例,女性4例,年龄12-40岁(平均25岁),所有病例均是深Ⅱ度烧伤创面愈合6-12个月瘢痕,瘢痕增生局限于皮损区,取材部位包括面颈部和四肢;NS组取自上述8例供皮区皮肤。临床收集的标本一部分于10%中性福尔马林溶液固定后,行HE及免疫组化染色;剩余标本保存于液氮,用于后续的Real-time PCR和Western-blot测定。
1、正常皮肤与增生性瘢痕组织形态学观察
10%中性福尔马林溶液固定后,制备正常皮肤与增生性瘢痕组织组织切片,行HE及γδTCR免疫组化染色。
2、测定正常皮肤与增生性瘢痕组织中IGF-1、IGF-1R、TGF-β的mRNA表达水平
用Trizol提取各组样本总RNA,采用Real-time PCR检测正常皮肤与增生性瘢痕组织中IGF-1、IGF-1R、TGF-β的mRNA相对表达量。
3、正常皮肤与增生性瘢痕组织中Akt、p-Akt、Fox01、p-Fox01蛋白水平测定
用RIPA液裂解各组样本组织,提取总蛋白,以β-actin作为内参,经Western-blot技术测定正常皮肤与增生性瘢痕组织中Akt、p-Akt、Fox01、p-Fox01的水平。
4、统计学处理
所有数据均用SPSS13.0软件处理。计量资料以x±s表示,组间差异用两样本均数的t检验进行比较。显著性用P值表示,P<0.05为差异有显著性。
结果:
1、正常皮肤与增生性瘢痕组织形态学变化
1.1 HE染色观察正常皮肤与增生性瘢痕组织病理变化光镜下观察:NS组光镜下可见表皮层次清晰,角化层角化明显,皮肤的附属器丰富,包括汗腺、皮脂腺、毛囊等结构。胶原纤维束排列规则,少而疏松、卷曲,细胞较少。HS组光镜下可见表面鳞状上皮基底层、棘层及角化层层次较清楚,可见较少角化现象。网状纤维和胶原纤维增多,排列规则;间质中炎性细胞消失;毛细血管闭合、退化、消失,可见较少的小动脉及小静脉。
1.2免疫组化观察γδT细胞在正常皮肤与增生性瘢痕组织中的分布γδT细胞在HS组表皮存在的数量明显高于NS组。
2、IGF-1、IGF-1R及TGF-β的mRNA在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的表达
HS组IGF-1mRNA的表达水平明显高于NS组,有统计学意义。HS组IGF-1RmRNA的表达水平明显高于NS组,有统计学意义。
HS组TGF-β mRNA的表达水平明显高于NS组,有统计学意义。
3、Westem-blot检测
Akt、p-Akt、Fox01、p-Fox01在正常皮肤和增生性瘢痕组织中的水平HS组Akt、Fox01的表达量与NS组相比无统计学意义;HS组p-Akt、p-Fox01的相对表达量明显高于NS组,有统计学意义。
结论:
1、在皮肤增生性瘢痕组织中,表皮γδ T细胞明显增多,提示表皮γδ T细胞在人的瘢痕形成中可能起重要作用。
2、在增生性瘢痕组织中,IGF-1、IGF-1R、TGF-β的mRNA的表达水平明显增高,表明三者参与了瘢痕的形成。
3、p-Akt、p-Fox01在皮肤增生性瘢痕组织中的表达较正常皮肤明显增多,提示Akt与Fox01磷酸化在瘢痕的形成中起重要作用。