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利用蚯蚓对养殖业废弃物及污水处理剩余污泥进行堆肥化处理,加速了废弃物向生物肥料的转化,作为一项环保、高效的绿色技术,为缓解日益增长的生活及生产性有机废弃物的环境压力起到十分重要的作用。耐药基因作为抗生素过度使用导致的一种新兴污染物,其环境归趋受到学界广泛关注。污泥及养殖废物含有大量耐药细菌及耐药基因,是耐药基因农田土壤环境扩散的重要来源。由于蚯蚓在土壤生态系统及蚯蚓堆肥系统中的核心作用,研究蚯蚓消化过程对耐药基因的作用机制,具有重要的环境与生态意义。本文利用蚯蚓(Eisenia Fetida)消解牛粪及生活污水处理剩余污泥,采用Illumina MiSeq高通量测序技术及实时荧光定量PCR技术,研究了蚯蚓肠道及蚯蚓粪细菌群落结构的演化规律,探讨了蚯蚓污泥取食过程肠道四环素抗性基因(TRGs)丰度的变化规律与机制,获得了以下主要结果。1、分别以牛粪(CD)及污泥(DS)两种不同饵料对蚯蚓进行养殖,分析蚯蚓前肠、后肠及成熟蚯蚓粪细菌群落结构的演化特征,结果表明:(1)蚯蚓肠道细菌群落多样性和丰富度较污泥饵料显著下降,但经后熟过程后蚯蚓粪细菌群落丰富度和多样性均显著提高。(2)从门水平看,蚯蚓肠道及成熟蚯蚓粪优势菌包括变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、绿弯菌门和厚壁菌门,其中变形菌门最为丰富,是蚯蚓堆肥过程的重要组成部分。(3)从纲水平看,β-变形菌纲(Betaproteobacteria)在CD和DS样品中的相对丰度分别占9.45%和35.79%,在砂囊(前肠)区域增加到73.02%和85.43%,后肠中逐渐减少,蚯蚓粪中降至6.44%和8.74%;γ-变形杆菌纲在CD和DS中占比13.7%和6.45%,在砂囊(前肠)中急剧下降,但在后肠中丰度有所恢复,其中HEDS扩增显著,并且在在蚯蚓粪中进一步增加。a-变形杆菌纲(Alphaproteobacteria)在CD和DS中占比2.5%左右,其丰度在蛇蚓肠道中均呈现不同程度的提高,在蚯蚓粪中有所降低,说明a-变形杆菌纲相对丰度的提高主要发生于肠道。(4)尽管饵料(CD与DS)间细菌群落结构差异较大,但经蚯蚓消化后差异减小并趋同,Amycolatopsis,Methylobacterium,Ralstoniaa,Ochrobactrum和Sphingomonas等细菌种类在蚯蚓肠道普遍存在。2、分别以四环素(TC)浓度为0,5,25及125 mg/kg的污泥为饵料,研究了 TC不同残留水平下蚯蚓肠道及蚯蚓粪细菌群落结构的演化规律,结果表明:(1)与对照相比,污泥残留TC显著增加了前肠细菌丰富度及多样性,在中、低浓度TC条件下后肠细菌多样性和丰富度显著下降,而高浓度条件下则呈相反趋势;蚯蚓粪细菌丰富度和多样性在各TC残留水平下均明显低于对照处理。(2)从细菌群落组成看,TC对肠道变形菌门有较强的抑制作用,但对放线菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、浮霉菌门、酸杆菌门具有明显的促进作用;在纲水平上主要抑制了肠道β-变形菌纲,对γ-变形菌纲、α-变形菌纲、厌氧绳菌纲、放线菌纲、热微菌纲、嗜热油菌纲、酸微菌纲等具有不同程度的促进作用;TC胁迫导致肠道尤其是前肠细菌群落结构的改变,可能对蚯蚓分解、转化饵料的效率产生影响,而不同TC残留水平之间相比,成熟蚯蚓粪群落结构差异较小,说明蚓粪后熟过程可以消除污泥TC残留对肠道细菌群落结构带来的影响。3、采用实时荧光定量PCR技术研究了不同TC浓度背景下,蚯蚓消解污泥过程肠道tetB、tetC、tetM、tet0、tetT、teZ、tetL、tetX等8种TRGs及intI1丰度的动态变化,结果表明:(1)在0～25mg/kg的TC浓度下,大多数TRGs和intI1在肠道系统中的丰度明显低于DS,5mg/kg的TC浓度对TRGs的丰度有抑制作用,25mg/kg的TC与对照相比差异不明显,而高浓度TC(125 mg/kg)背景下,肠道尤其是后肠TRGs和intI1丰度明显高于对照,其中tetB、tetZ、tetM、tetT等含量明显高于DS,说明控制污泥TC含量对后续堆肥过程耐药基因的控制具有重要意义。(2)对蚯蚓肠道15个优势菌属与TRGs的RDA冗余分析结果表明,蚯蚓肠道优势类群对TC敏感,后肠环境可以降低TRGs丰度,恢复前肠受抑制的优势类群。与前肠相比,后肠TRGs之间的相关性更强,推测携带多重TRGs细菌宿主在后肠中比在前肠中更丰富。(3)根据细菌丰度与TRGs丰度的相关性,发现共有18个属可能是蚯蚓肠道TRGs宿主,其中,前肠5个特有属包括蚯蚓肠道常见类群外,还包括可能来自污泥的类群;蚯蚓肠道共享细菌包括Caldilinea、Unclassified_JG30-KF-CM45、Unclassified_Actinomycetales、Unclassified_A cidimicrobiales、Unclassified_HOC36 等5 个属。其中Unclassified_Actinomycetale 和Acidimicrobiale 是蚯蚓肠道主要类群,而Caldilinea则来源于饵料;后肠包含丰富TRB的3个属并未出现在前15个丰富属中,其中Thermomonas、Unclasstfied_Chitinophagaceae丘蚓堆肥或蚯蚓肠道中大量存在,由于它们在蚯蚓后肠丰度的大幅提高,因此其可能导致的TRGs扩散风险值得关注。