目的:1.观察不同程度寻常痤疮患者外周血中辅助性T细胞17(T helper 17 cells,Th17细胞)/调节性T细胞(regulatory T cells,Treg细胞)比例及白细胞介素-17(Interleukin 17,IL-17)、白细胞介素-23(Interleukin 23,IL-23)、白细胞介素-6(Interleukin 6,IL-6)、转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的表达及差异。2.通过体外实验建立兔耳痤疮模型,观察IL-17、IL-6、TGF-β1在痤疮皮损中的表达情况,并初步探讨不同浓度超分子水杨酸治疗兔耳痤疮模型的效应机制,为寻常痤疮非抗生素治疗提供新的靶点及理论依据。方法:1.研究对象共125人,包括健康对照组30例,寻常痤疮患者组共95例(轻度痤疮30例,中度痤疮32例,重度痤疮33例)。收集每一例研究对象外周静脉血6mL,用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)测定外周血Th17/Treg细胞比例;用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定外周血血清中IL-17、IL-23、IL-6及TGF-β1浓度。2.选择12周龄健康清洁级雄性新西兰大耳白兔30只作为实验对象,随机抽取24只兔子(48只兔耳)作为造模组,利用Kligman法建造兔耳痤疮模型,6只兔子(12只兔耳)作为正常对照组,不做任何处理。将粗制煤焦油外涂于造模组兔耳的双侧耳管开口2cm×2cm处,每日1次,每次约0.5ml/耳,连续14d,于造模第7d时皮下多点注射痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes,P.acnes)菌悬液,浓度为1×10~8CFU/ml,约50ul/耳。将造模成功的24只兔子随机分为模型对照组、阳性对照组、2%超分子水杨酸组、30%超分子水杨酸组,每组6只兔子(12只兔耳)。模型对照组涂抹生理盐水,每天1次,连续28天;阳性对照组涂抹夫西地酸乳膏,每天1次,连续28天;2%超分子水杨酸治疗组涂抹2%超分子水杨酸祛痘调理凝露,每天1次,连续28天;30%超分子水杨酸治疗组涂抹30%超分子水杨酸焕颜面膜,每周1次,连续4周。于治疗前(造模后即刻)、治疗后第7d、第14d、第21d、第28d对实验各组的疗效进行肉眼及皮肤镜观察;于治疗前(验证是否造模成功)、治疗后第14d、第28d对实验各组兔耳皮损做皮肤活检,HE染色,于光镜下观察标本组织形态学改变,用形态学图像分析系统测量并记录各组兔耳表皮及角质层厚度、皮脂腺直径、毛囊及其角化程度、真皮炎性浸润程度,同时用免疫组化法检测IL-17、IL-6、TGF-β1蛋白的表达情况。结果:1.外周血Th17/Treg细胞表达:(1)中重度痤疮患者Th17细胞比例与痤疮严重程度呈正相关,且明显高于健康人及轻度痤疮患者,差异均有统计学意义(P<0.05);中重度痤疮患者之间差异有统计学意义(P<0.05);轻度痤疮患者与健康人之间无统计学差异(P>0.05)。(2)轻中重度痤疮患者Treg细胞比例与痤疮严重程度呈负相关,且明显低于健康人,差异有统计学意义(P<0.05),轻中重度痤疮患者之间差异有统计学意义(P<0.05)。(3)轻中重度痤疮患者Th17/Treg比值与痤疮严重程度呈正相关,且明显高于健康人,差异均有统计学意义(P<0.05);轻中重度痤疮患者之间差异有统计学意义(P<0.05)。2.外周血血清中IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β1的表达水平:中重度痤疮患者IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β1表达水平与痤疮严重程度呈正相关,且明显高于健康人及轻度痤疮患者,差异均有统计学意义(P<0.05);中重度痤疮患者之间差异有统计学意义(P<0.05);轻度痤疮患者与健康人之间无统计学差异(P>0.05)。3.痤疮兔耳造模结果:(1)肉眼观察:肉眼可见兔耳增厚、变硬,毛囊口进一步增大并局部隆起呈米粒至黄豆大小红色炎性丘疹,其上附着明显的黄白色或黑色毛囊角栓、粉刺等,甚至可见脓疱。(2)皮肤镜观察:红色背景下见可见弥漫分布的明显粗大的毛孔,大量白色及黑色粉刺样结构,可见散在的毛囊性炎性丘疹,其上附着油腻样鳞屑,皮疹间可见多形性血管影。(3)组织学观察:各层细胞排列紊乱,表皮和毛囊上皮不规则增厚,角质层角化过度,部分颗粒层和棘层也相应增厚;毛囊口重度扩张,角化明显,毛囊腔及开口部被红染致密的角化物质充填,漏斗部扩大,呈壶状,见巨大角栓;单个腺体皮脂腺腺体直径增大,分叶增多;毛囊面积扩大,部分相邻扩张的毛囊可见融合;真皮上层毛细血管明显扩张,毛囊及毛细血管周围可见炎性浸润。(4)正常对照组与造模组兔耳组织分别经实验性痤疮组织学判定标准进行分级,病理学改变分级(Z=-3.140,P=0.002)、病理评分(Z=-3.140,P=0.002)的差异均有统计学意义。其中造模组兔耳的病理评分高于正常对照组。(5)HE染色各项测量指标:a.造模组兔耳组织表皮层、角质层厚度、皮脂腺直径、毛囊面积较正常对照组显著增加,差异均有统计学意义(t=-9.657,P<0.001;t=-7.324,P<0.001;t=-10.874,P<0.001;t=-6.494,P=0.001)。b.正常对照组与造模组兔耳毛囊内角化程度(Z=-3.146,P=0.002)、角化程度评分(Z=-3.146,P=0.002)的差异均有统计学意义。其中造模组角化程度评分高于正常对照组。c.正常对照组与造模组兔耳真皮炎性浸润程度(Z=-3.108,P=0.002)、浸润程度评分(Z=-3.108,P=0.002)的差异均有统计学意义。其中造模组浸润程度评分高于正常对照组。(6)免疫组化染色结果:在痤疮模型兔耳组织中,IL-17、IL-6、TGF-β1三者的MOD值分别为0.23±0.01、0.23±0.02、0.22±0.01;在正常对照组皮肤组织中,三者的MOD值分别为0.16±0.01、0.12±0.02、0.16±0.03。两组比较差异显著,均有统计学意义(t=-10.305,P<0.001;t=-8.833,P<0.001;t=-4.615,P=0.005)。4.四组痤疮兔耳模型的疗效结果:(1)肉眼及皮肤镜观察:治疗后第7d、第14d、第21d、第28d,各组粉刺、炎性丘疹逐渐减少、毛孔扩张程度、毛囊角栓有不同程度的减轻,油腻样鳞屑、皮肤粗糙程度等均有不同程度的减轻,2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)与30%超分子水杨酸治疗组方案(1次/w)疗效相当,并优于阳性对照组,模型对照组次之。(2)组织学观察:治疗后第14d、第28d,表皮及毛囊上皮增厚逐渐减轻,毛囊口缩小,角化逐渐减轻,皮脂腺逐渐缩小、分叶减少,炎性细胞浸润有不同程度的减轻,2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)与30%超分子水杨酸治疗组方案(1次/w)疗效相当,并优于阳性对照组,模型对照组次之。(3)四组兔耳组织病理学改变分别经实验性痤疮组织学判定标准分级:a.组间比较:治疗第14d时(χ~2=2.738,P=0.434)及治疗第28d时(χ~2=7.156,P=0.067)四组兔耳组织病理学改变分级组间比较均无统计学差异。b.组内比较:阳性对照组治疗第14d与治疗第28d的组织病理学改变分级差异具有统计学意义(Z=-2.000,P=0.046),模型对照组、2%超分子水杨酸治疗组及30%超分子水杨酸治疗组在治疗第14d与治疗第28d均无统计学差异(Z=-1.000,P=0.317;Z=-1.732,P=0.083;Z=-1.732,P=0.083)(4)HE染色各项测量指标检测:(1)表皮层厚度:a.组间比较:治疗第14d(F=3.983,P=0.022)、治疗第28d时(F=24.429,P<0.001),四组差异均具有统计学意义;b.组内比较:阳性对照组、2%超分子水杨酸治疗组及30%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的表皮层厚度均较治疗第14d变薄,且差异均具有统计学意义(t=6.919,P=0.001;t=4.011,P=0.010;t=5.865,P=0.002)。(2)角质层厚度:a.组间比较:治疗第14d(F=10.618,P<0.001)、治疗第28d时(F=8.065,P=0.001),四组差异均具有统计学意义;b.组内比较:模型对照组、2%超分子水杨酸治疗组及30%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的角质层厚度均较治疗第14d变薄(t=7.020,P=0.001;t=10.363,P<0.001;t=8.243,P<0.001),且差异均具有统计学意义(P均<0.05)。(3)皮脂腺直径:a.组间比较:治疗第14d(F=25.562,P<0.001)、治疗第28d时(F=30.794,P<0.001),四组差异均具有统计学意义;b.组内比较:模型对照组、阳性对照组、2%超分子水杨酸治疗组及30%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的皮脂腺直径均较治疗第14d变小,且差异均具有统计学意义(t=4.649,P=0.006;t=11.049,P<0.001;t=7.290,P=0.001;t=5.076,P=0.004)。(4)毛囊面积:a.组间比较:治疗第28d时,四组差异具有统计学意义(F=14.375,P<0.001)。b.组内比较:阳性对照组、2%超分子水杨酸治疗组及30%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的平均毛囊面积均较治疗第14d缩小,且差异均具有统计学意义(t=3.963,P=0.011;t=6.891,P=0.001;t=5.183,P=0.004)。(5)毛囊内角化程度:a.组间比较:治疗第28d时,四组差异具有统计学意义(χ~2=14.750,P=0.002);b.组内比较:阳性对照组治疗第28d毛囊内角化程度较治疗第14d减轻,差异具有统计学意义(Z=-2.236,P=0.025)。(6)真皮炎性浸润程度:a.组间比较:治疗第28d时,四组差异具有统计学意义(χ~2=13.860,P=0.003);b.组内比较:30%超分子水杨酸治疗组真皮炎性浸润程度治疗第28d较治疗第14d减轻,差异具有统计学意义(Z=-2.000,P=0.046)。(5)免疫组化染色结果:(1)IL-17蛋白平均表达水平:a.组间比较:治疗第14d时(F=1.324,P=0.295)及治疗第28d时(F=1.637,P=0.213),四组组间比较均无明显差异。b.组内比较:模型对照组及2%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的IL-17蛋白平均表达水平均较治疗第14d降低,且差异均具有统计学意义(t=2.730,P=0.041;t=4.727,P=0.005)。(2)IL-6蛋白平均表达水平:a.组间比较:治疗第14d(F=22.733,P<0.001)、第28d时(F=17.613,P<0.001),四组差异均具有统计学意义;b.组内比较:模型对照组、阳性对照组、2%超分子水杨酸治疗组、30%超分子水杨酸治疗组治疗第28d的IL-6蛋白平均表达水平均较治疗第14d降低,且差异均具有统计学意义(t=4.223,P=0.008;t=7.442,P=0.001;t=3.866,P=0.012;t=6.744,P=0.001)。(3)TGF-β1蛋白平均表达水平:a.组间比较:治疗第28d时(F=4.776,P=0.011),四组差异具有统计学意义;b.组内比较:阳性对照组治疗第28d的TGF-β1蛋白平均表达水平均较治疗第14d降低,且差异均具有统计学意义(t=3.392,P=0.019)。结论:1.中重度痤疮患者外周血Th17细胞、IL-17、IL-23、IL-6、TGF-β1表达水平异常增高,而Treg细胞增殖不足,Th17/Treg比例失衡,提示Th17/Treg细胞轴及相关炎症因子可能在痤疮发生发展中具有相应作用,推测其可能成为痤疮治疗新的靶点。2.采用Kligman法成功建造了痤疮兔耳模型,且兔耳痤疮模型皮损中IL-17、IL-6、TGF-β1蛋白的表达有不同程度的升高。3.2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)与30%超分子水杨酸治疗组方案(1次/w)能不同程度的减轻兔耳痤疮模型表皮层厚度、角质层厚度、皮脂腺扩张程度、毛囊扩张程度、真皮炎性浸润程度,但对毛囊内角化程度有减轻并不明显。4.2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)与30%超分子水杨酸治疗组方案(1次/w)能不同程度的减轻IL-6、TGF-β1的表达水平,但对IL-17的表达水平减轻并不明显。5.2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)与30%超分子水杨酸治疗组方案(1次/w)对实验性兔耳痤疮均具有治疗作用,且治疗第28d较治疗第14d治疗效果更佳;在抗角化及抗炎能力方面,2%超分子水杨酸治疗组方案(1次/d)具有一定倾向性的优势。