茯砖茶“发花”过程中微生物多样性研究

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茯砖茶属于完全发酵茶,是所有茶类中加工工艺最复杂,最独特的黑茶类产品。在茯砖茶成品的茶叶中普遍存在俗称“金花”的金黄色小点,这是茯砖茶区别于其它砖茶的重要特征。“金花”是茯砖茶中的冠突散囊菌产生的金黄色闭囊壳,“金花”的多少是茯砖茶品质好坏的重要指标。为充分利用茯砖茶微生物资源,提高茯砖茶品质的质量,挖掘茯砖茶微生物潜在资源,开发具有促进茯砖茶快速“发花”功能的高附加值微生物发酵产品,本文以不同产区的茯砖茶产品和茯砖茶原料为试验材料,研究了茯砖茶的微生物多样性;运用分子生物学方法中的PCR-DGGE分析,结合连接转化技术对茯砖茶茶样中的微生物DNA进行了测序;通过传统微生物分离纯化,得到茯砖茶中优势酵母菌,通过镜检和分子学鉴定为德巴利氏酵母菌,并对其生理特性进行了研究,得到以下主要结论:(1)首先通过传统微生物技术,对不同茯砖茶茶样进行分离纯化,得到不同微生物菌落,经过计数后进行显微镜镜检,得到各种微生物在茯砖茶不同“发花期”中的分布情况。对统计数据进行分析过后,发现冠突散囊菌是茯砖茶“发花期”中的优势微生物,其在各个“发花期”均能被检出,并且菌落数比例达到50%以上;散囊属的微生物在“发花期”中被检出的比例也很大;青霉和黑曲霉在“发花期”的前期检出比例较大,它们都是茯砖茶“发花”的污染菌,通过水分分析可以得到可以得出在湿度较大的茯砖茶中有利于污染菌的生成,对茯砖茶的正常出产产生负面影响,可以考虑在“发花期”中减少湿度以降低污染菌的生长率。(2)采用液氮研磨法对不同茯砖茶茶样进行DNA提取,并将茯砖茶微生物的DNA产物进行PCR基因扩增,通过对得到的PCR产物DGGE分析,然后经过连接,转化,测序,最终得到茯砖茶中优势微生物的基因序列,将此序列在NCBI网站的BLAST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行对比,确定微生物的种属。结果表明:冠突散囊菌是茯砖茶的优势菌种,兼有诸如赤散囊菌,匍匐散囊菌等散囊菌属的微生物。检测出的黑曲霉和青霉属于发花期的污染菌,需要控制发花流程减少污染。汉逊德巴利酵母可能对茯砖茶特殊品质的形成有促进作用,其具体机制还有待考究。(3)通过微生物分离纯化技术得到茯砖茶“发花”过程中的优势酵母菌,通过显微镜镜检,并结合分子生物学实验技术对其进行DNA提取,然后进行PCR基因扩增后并测序,通过此序列在NCBI网站BLAST数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)上进行对比,得到该酵母菌的种属。结果表明:茯砖茶“发花期”中优势酵母菌是汉逊德巴利酵母,这是首次在茯砖茶中确立汉逊德巴利酵母为茯砖茶“发花期”的优势菌种,该菌的发现对于研制茯砖茶快速“发花”及保障并提高茯砖茶的特殊风味有重要意义。(4)对从茯砖茶“发花”过程中优势酵母菌汉逊德巴利酵母进行生理特性研究:发现汉逊德巴利酵母的适宜培养温度是28℃左右,适宜培养的Nacl含量是8-10%,适宜培养的pH为4-7。通过对汉逊德巴利酵母和冠突散囊菌混合发酵后,抽提粗酶液,进行纤维素酶平板法测定,发现在短期培养时,两种菌的混合培养能够增加纤维素透明圈的直径,可能是短期培养时汉逊德巴利酵母能促进冠突散囊菌的生长;而在混合培养中冠突散囊菌生长到一定阶段,会使透明圈直径变小,可能是冠突散囊菌在生长到一定阶段能产生一种抑制其他微生物生长的物质。
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