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研究背景动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是一种慢性炎症性疾病,发生在AS不稳定斑块基础上的急性血栓形成是导致心血管急症的主要原因。同时,经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention,PCI)后的血管再狭窄和血栓形成是严重影响患者预后的主要并发症。PCI时由于内皮被剥脱、管壁受损伤,导致凝血反应和炎症反应的启动,血小板及白细胞募集到局部并释放大量细胞因子和生长因子,引起平滑肌细胞的迁移、增殖,出现细胞外基质的沉积和血管重塑,终致新生内膜形成和管腔狭窄。白细胞表面的P-选择素糖蛋白配体-1(P-selectin glycoprotein ligand-1,PSGL-1)可与激活的血小板或内皮细胞表面的P-/E-选择素结合,从而导致血小板-白细胞聚集体形成,及白细胞在损伤血管处的粘附和浸润。前期研究中,我们已将能够同PSGL-1结合的金黄色葡萄球菌超抗原样蛋白-5(staphylococcal superantigen like protein-5,SSL5)与凝血因子Xa(FXa)的强效抑制剂蜱抗凝血肽(tick anticoagulant peptide,TAP)联合,构建了重组融合蛋白TAP-SSL5。它可与PSGL-1有效结合,并可显著抑制血浆FXa活性,从而具有抗炎抗凝双重作用。本课题在前期研究基础上,采用双光子显微镜,研究TAP-SSL5对氯化铁诱导的小鼠肠系膜动脉血栓形成的影响;采用流式细胞术,研究TAP-SSL5对血小板-淋巴细胞结合的影响;并构建巴马小型猪颈动脉球囊损伤模型,初步评价TAP-SSL5对动脉球囊损伤后内膜增生的作用;旨在进一步研究融合蛋白TAP-SSL5的功能。研究方法1.融合蛋白TAP-SSL5对小鼠肠系膜动脉血栓形成的影响:采用C57BL/6J小鼠,随机分为PBS对照组、SSL5组(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)、T175P组(SSL5无功能突变体)、TAP组及TAP-SSL5组(1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg)(n=3-5),经尾静脉一次注射PBS或上述重组蛋白。用10%Fe Cl3诱导小鼠肠系膜动脉损伤,在双光子显微镜下连续观测,以血管损伤至管腔闭塞的时间(occlusion time,OT)反映血栓形成时间,OT越长说明药物的抗血栓作用越强。2.融合蛋白TAP-SSL5对激活的血小板与淋巴细胞结合的影响:采用免疫磁珠分选法分离人外周血淋巴细胞;CCK8法检测重组蛋白对细胞活力的影响;以流式细胞仪检测Jurkat细胞表面PSGL-1的表达,及TAP-SSL5对KPL-1与PSGL-1结合的影响;以20μmol/L的ADP激活血小板,流式细胞仪检测TAP-SSL5对激活血小板与Jurkat细胞或人外周血淋巴细胞结合的影响。3.融合蛋白TAP-SSL5对小型猪颈动脉球囊损伤后内膜增生的影响:以PTCA球囊扩张的方法构建巴马小型猪颈动脉球囊损伤模型;分为3组初步观察重组蛋白对小型猪颈动脉球囊损伤后新生内膜形成的作用,分别为生理盐水对照组、1mg/kg TAP-SSL5组、1mg/kg SSL5组,耳静脉注射给药,1次/周。损伤后28天,取颈动脉及主要脏器切片行HE染色,采用Image Pro Plus 6.0软件检测最大内膜厚度、新生内膜和中膜面积,计算内膜/中膜面积比。结果1.在PBS对照组、T175P组小鼠肠系膜动脉损伤后闭塞时间(OT)分别为12.14±0.82min、13.06±0.42min;给予小鼠2 mg/kg TAP静脉注射后,其OT为19.70±0.84min;在10 mg/kg SSL5组OT为29.75±4.19min;在10 mg/kg TAP-SSL5组OT延长至38.73±2.21min(与PBS对照组相比,P<0.01,与TAP组、10 mg/kg SSL5组相比,P<0.05;n=3-5)。2.30 mg/L及以下浓度的TAP-SSL5和10 mg/L的SSL5对Jurkat细胞活力无明显影响;10 mg/L的TAP-SSL5能够明显抑制KPL-1与Jurkat细胞的结合;ADP激活的血小板与Jurkat细胞结合率为(11.86±4.49)%,细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,结合率降至(6.73±2.71)%(P<0.05);ADP激活的血小板与人外周血淋巴细胞结合率为(8.32±1.00)%,细胞经10 mg/L TAP-SSL5预先处理后,结合率降至(5.51±0.70)%(P<0.05)。3.给予巴马小型猪颈动脉直径1.4倍的PTCA球囊扩张,在术后28d可诱导出显著的新生内膜形成;初步结果显示,1mg/kg TAP-SSL5可抑制小型猪颈动脉球囊损伤后新生内膜形成,且对小型猪心脏、肝脏、肺、肾脏等主要脏器组织病理无明显影响。结论融合蛋白TAP-SSL5显著延长小鼠肠系膜动脉损伤后管腔闭塞时间,表明其可抑制小鼠肠系膜动脉血栓的形成;TAP-SSL5可与淋巴细胞表面的PSGL-1结合,进而抑制ADP激活的血小板与淋巴细胞的结合;采用PTCA球囊损伤的方式,能够诱导广西巴马小型猪颈动脉的新生内膜形成,初步结果显示TAP-SSL5对小型猪颈动脉损伤后新生内膜形成有抑制作用,且对主要脏器组织病理学无明显影响。