增生性瘢痕(hypertrophic scar,HS)是最常见的烧伤后皮肤愈合过程中产生的病理性变化,发生率高达70%,致残率约48%。伴随医疗技术的迅猛发展,近些年烧伤患者的生活质量和生存率得到了很大提高。然而,严重烧伤患者治愈后通常伴随大量增生性瘢痕的形成,不仅影响美观,而且伴有疼痛和瘙痒,甚至影响运动。对患者心理造成创伤,生活质量也大幅度下降。因此增生性瘢痕的形成机制以及治疗方法日益受到人们的重视,探求有效消除瘢痕的方法具有重大临床意义。microRNA(miRNA)是一类内源非编码RNA,一般长度在21-25 nt,通常在转录后调节中发挥重要作用,参与皮肤类疾病发生发展以及皮肤遭受创伤后的修复过程。既往研究表明,miR-29b的异常表达同心脏、肾脏、肺等多种器官的纤维化病变密切相关。并被证实可以靶向抑制胶原蛋白、弹性蛋白以及原纤蛋白1的表达。此外,miR-29b通过调节TGF-β1的表达影响肌腱愈合过程。更有新近研究发现,疤痕组织中miRNA-29b的表达较正常皮肤组织显著下降,过表达后能够有效抑制成纤维细胞中CollagenⅠ的表达。提示miRNA-29b很可能同增生性瘢痕形成密切相关,但具体分子调控机制尚不清楚,仍需深入探索。骨形成蛋白7(Bone morphogenetic proteins-7,BMP-7)是TGF-β超家族成员,调控细胞增殖、分化和凋亡等重要生命过程,参与组织损伤后再生修复,同肝、肾和角膜纤维化的发生发展密切相关。现有研究表明,BMP-7在肾纤维化小鼠模型中的表达显著降低,Vitamin E通过增加其表达减轻肾纤维化。BMP-7亦被证实可以抑制大鼠毛乳突细胞(DPCs)向成纤维细胞转化。此外,在TGF-β1诱导的大鼠肝上皮细胞模型中,BMP-7通过降低α-SMA和p-Smad2/3的表达减轻肝纤维化。提示BMP-7很可能参与伤口愈合,抑制增生性瘢痕形成。本研究通过建立小鼠烫伤模型,皮下注射miR-29b mimics或重组人BMP-7进行干预。观察两者对小鼠烫伤创面愈合、瘢痕组织病理学变化、胶原蛋白、纤维化蛋白及细胞凋亡的影响,并深入探讨miRNA-29b对TGF-β1/Smad/CTGF信号通路以及BMP-7对BMP-7/Smad1/5/8信号通路的调控作用,明确miR-29b和BMP-7在增生性瘢痕形成中的作用和具体分子机制。旨在进一步阐明增生性瘢痕的发病机理,并为其临床治疗提供新型分子靶点和更多的理论依据。1.miR-29b过表达对创伤愈合及瘢痕病理学变化的影响目的:分析miR-29b mimics对烫伤创面愈合及瘢痕组织病理学变化是否有影响,明确miR-29b参与调控增生性瘢痕形成。方法:采用C57BL/6小鼠建立烫伤动物模型,皮下注射miR-29b mimics进行干预。随机平均分为Control组、thermal injury组、thermal injury+negative control组和thermal injury+miR-29b组。烫伤后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d观察各组小鼠创面愈合情况,拍照记录;HE染色观察瘢痕组织病理学变化;Masson染色观察瘢痕组织胶原纤维形成情况;Real-time PCR检测瘢痕组织中miR-29b表达水平。结果:Real-time PCR检测结果显示,烫伤后小鼠瘢痕组织中miR-29b的表达显著下降,差异具有统计学意义(P<0.001)。创面愈合观察结果显示,小鼠烫伤后形成明显创面面积,thermal injury+miR-29b组中创面面积在10 d和14 d时间点较thermal injury组显著减小(P<0.01或P<0.001)。HE及Masson染色结果显示,thermal injury组瘢痕组织表皮棘层明显增厚,血管周围出现炎性细胞浸润,成纤维细胞大量增生,胶原纤维数量显著增多,粗大致密,排列紊乱,采用miR-29b mimics干预后,thermal injury+miR-29b组小鼠皮肤表皮棘层明显变薄,可见完整的毛囊结构,炎性细胞基本消失,胶原纤维含量减少且变细,排列方向较为规整,纤维束间隙变大。结论:miRNA-29b可以有效改善瘢痕病理学变化,参与调控增生性瘢痕的发生发展过程,为后续分子调控机制的深入探索打下了坚实的基础。2.miR-29b过表达对TGF-β1/Smad/CTGF通路及瘢痕形成相关蛋白表达的影响目的:分析miR-29b mimics对TGF-β1/Smad/CTGF信号通路活性及CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA表达的影响,明确miR-29b影响增生性瘢痕形成的具体分子机制。方法:Real-time PCR技术检测Control组、thermal injury组、thermal injury+negative control组和thermal injury+miR-29b组小鼠瘢痕组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF m RNA表达;Western blot技术分析各组小鼠瘢痕组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF、Smad2/3和p-Smad2/3蛋白的表达。结果:Real-time PCR检测结果显示,同Control组比较,thermal injury组中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF m RNA的表达均显著上升,差异具有统计学意义(P<0.001);皮下注射miR-29b mimics进行干预后,thermal injury+miR-29b组中各指标m RNA的表达较thermal injury组显著下降(P<0.05或P<0.01或P<0.001)。Western blot检测结果显示,同Control组比较,thermal injury组中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF、p-Smad2/3蛋白的表达显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01),皮下注射miR-29b mimics进行干预后,各指标蛋白表达水平明显下降(P<0.05),同分子水平变化趋势一致。结论:miR-29b能够调节TGF-β1/Smad/CTGF信号通路活性,抑制瘢痕形成相关蛋白的表达,从而改善胶原沉积,减轻病理性瘢痕生成。3.BMP-7对创面愈合、瘢痕病理学变化及相关蛋白表达的影响目的:分析重组人BMP-7对烫伤创面愈合、瘢痕组织病理学变化及CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF蛋白表达的影响,明确BMP-7是否参与调控病理性瘢痕形成。方法:采用C57BL/6小鼠建立烫伤动物模型,皮下注射不同剂量(25、50、100μg)rh BMP-7进行干预。随机平均分为Control组、thermal injury组和thermal injury+BMP-7组。烫伤后0 d、3 d、7 d、10 d、14 d观察各组小鼠创面愈合情况,拍照记录;HE染色观察瘢痕组织病理学变化;Masson染色观察瘢痕组织胶原纤维形成情况;根据上述实验结果确定rh BMP-7最佳剂量后,Western blot检测CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF蛋白的表达。结果:创面愈合观察结果显示,100μg rh BMP-7干预后,thermal injury+BMP-7组小鼠的创伤面积在7 d、10 d、14 d时间点较thermal injury组明显减小,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01或P<0.001);HE及Masson染色结果显示,thermal injury组小鼠皮肤表皮棘层明显增厚,炎性细胞浸润,成纤维细胞和胶原纤维数量显著增多,胶原纤维粗大且排列无序,皮下注射rh BMP-7后瘢痕组织性病理学变化得到明显改善,且呈剂量依赖性;Western blot检测结果显示,烫伤后小鼠瘢痕组织中CollagenⅠ、CollagenⅢ、α-SMA、TGF-β1、CTGF蛋白表达显著升高(P<0.05或P<0.01),皮下注射100μg rh BMP-7可以明显降低上述蛋白的表达(P<0.05)。结论:BMP-7可以有效减少CollagenⅠ和CollagenⅢ含量,抑制胶原沉积,降低α-SMA、TGF-β1、CTGF表达水平,阻止胶原纤维大量增生,改善瘢痕性病理学变化,进而影响瘢痕形成。4.BMP-7对瘢痕组织中细胞凋亡及Smad通路的影响目的:分析重组人BMP-7对瘢痕组织中细胞凋亡、凋亡相关蛋白及BMP-7、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8表达的影响。方法:TUNEL法检测thermal injury组和thermal injury+BMP-7 100μg组中细胞凋亡情况;Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、cleaved capase-3和信号通路相关蛋白BMP-7、Smad1/5/8、p-Smad1/5/8的表达。结果:TUNEL检测结果显示,采用BMP-7干预后thermal injury+BMP-7 100μg组细胞凋亡数量较thermal injury组显著增多;Western blot检测结果显示,皮下注射100μg rh BMP-7可以显著升高Bax/Bcl-2比例,同时增加cleaved capase-3、BMP-7、p-Smad1/5/8表达,差异均具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结论:BMP-7能够激活BMP-7/Smad1/5/8信号通路,升高Bax/Bcl-2比例,并增加cleaved capase-3表达,促进可成纤维细胞凋亡,影响病理性瘢痕形成。