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研究目的: 本研究探索CREB对肾细胞癌(renal cell carcinoma,RCC)增殖中的影响,以及纺锤体与动粒相关复合物2(Spindle and kinetochore associated complex2,SKA2)在此过程中的作用。 实验方法: 1.用QRT-PCR和蛋白印记(Western blot)检测CREB在肾癌病人癌组织、癌旁组织及肾癌细胞系中的表达水平;2.利用RNA干扰(RNAi)技术,瞬转siCREB降低细胞内CREB的表达水平后,观察其对细胞增殖的影响;3.用生物信息学分析和CHIP实验探讨SKA2是否为CREB的下游靶基因;4.用QRT-PCR和Western blot检测SKA2在肾癌细胞系中的表达水平、降低SKA2的表达后对肾癌细胞增殖的影响、转染CREB高表达质粒(pCI-neo/CREB)后,研究其是否逆转 siSKA2调节的细胞增殖和细胞周期阻滞;5.设计针对 CREB的短发卡 RNA(shRNA),通过慢病毒系统构建稳定低表达CREB的OS-RC-2细胞系,观察其对裸鼠皮下成瘤能力和瘤块内 SKA2蛋白表达的影响;6.用QRT-PCR检测肾癌组织及癌旁组织内SKA2的表达、用皮尔森相关分析法分析 CREB和 SKA2在组织中二者的相关性、最后用免疫组化法分析166例临床标本中CREB和SKA2的蛋白表达及定位、并用斯皮尔曼相关分析法分析二者关系。 实验结果: (1)肾癌组织和细胞中CREB的表达水平显著性高于对照; (2) siCREB降低细胞内CREB的表达后,显著性抑制了肾癌细胞的增殖; (3)细胞实验发现,降低细胞内 CREB水平后伴随着 SKA2蛋白表达的降低;此外,CHIP实验也证实SKA2是CREB的靶基下游因; (4)降低细胞内高表达的SKA2后,能显著性抑制细胞的增殖;然而,高表达CREB后能逆转siSKA2处理引起的细胞增殖抑制和细胞分裂中期停滞; (5)裸鼠皮下注射携带有低表达 CREB的肿瘤细胞后,瘤块大小显著性低于对照;此外,瘤块组织内SKA2基因和蛋白的表达也被显著性抑制; (6)分析166例临床组织标本发现,同一病人组织中SKA2和CREB的mRNA水平呈显著性正相关;二者的染色强度都随着肾癌分期恶性程度的增加而增加。 结论: CREB在肾癌组织及细胞中高表达;降低细胞内CREB的表达可以在体内外抑制肿瘤细胞的生长,其机制是通过降低周期相关蛋白SKA2的表达;低表达CREB抑制裸鼠体内成瘤并降低瘤块组织内SKA2的表达;CREB和SKA2在肾癌组织中呈正相关,并且二者的染色强度都随着肾癌分期恶性程度的增加而增加。