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目的：恶性胶质瘤等原发脑瘤对人类危害极大,骨髓间充质干细胞(bonemarrow mesenchymal stem cells,BMSCs)能够向胶质瘤发生趋化性迁移,并且具有易于获得、多向分化等优点,因而成为治疗胶质瘤最具希望的治疗手段。但是,关于不同分化状态细胞迁移的研究还较少。本实验旨在探讨成神经分化的BMSCs向干细胞因子(stem cell factor,SCF)的迁移行为。
方法：
(1)采用Percoll密度梯度分离法分离BMSCs,并在体外扩增培养,通过免疫细胞化学染色的方法检测表面抗原,以及成脂、成骨诱导分化鉴定。
(2)采用抗氧化剂丁羟基茴香醚(BHA)及bFGF联合诱导BMSCs向神经样细胞分化,首先用浓度为10 ng/ml的bFGF预诱导24 h,之后加入浓度为200μM的丁羟基茴香醚(BHA)和2％的二甲基亚砜(DMSO)诱导5 h,再用含有N2的H-DMEM维持48 h。观察诱导分化过程中BMSCs的形态变化,并且通过免疫荧光染色方法检测神经细胞特异性标志物nestin、β-Ⅲ-tubulin和NSE的表达情况。
(3)用Dunn chamber研究成神经分化BMSCs向SCF的定向迁移行为,通过德国Leica AF6000活细胞工作站拍摄迁移图像,应用NIH Image J分析图像,计算细胞的迁移速率、迁移效率以及迁移轨迹。并研究了PI3K抑制剂LY294002处理后BMSCs迁移行为的变化。
结果：
(1)采用Percoll细胞分离液密度梯度法,成功分离培养出大鼠骨髓间充质干细胞,免疫荧光染色显示CD29、CD90、CD106呈阳性,CD34呈阴性,并且能够分化成脂肪细胞和成骨细胞。
(2)用bFGF/BHA诱导BMSCs向神经样细胞分化,预诱导24 h,细胞形态变化较小,仍为长梭形；诱导5 h后细胞胞体出现回缩、有突触伸出,形态改变较大,初步展现出神经细胞的形态特征:维持培养18h,细胞分叉稍有增多；维持48 h后,细胞分叉数目增多,并且产生二级分叉,类似于成熟神经元的形态。对照组细胞无明显的形态变化,免疫荧光染色显示诱导的细胞表达神经细胞标志物nestin、β-Ⅲ-tubulin以及NSE。
(3)Dtmn chamber迁移实验显示,SCF诱导实验组细胞的迁移速率和迁移效率明显高于对照组,表明SCF对BMSCs具有趋化作用。此外,分化不同状态的BMSCs向SCF的趋化迁移程度也不同。另外,PI3K信号通路抑制剂LY294002能够降低BMSCs的迁移速率和效率。
结论：BMSCs可以分化为神经样细胞,其对SCF的趋向性迁移与分化状态密切相关,并且PI3K信号通路参与该迁移过程。