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椰毒假单胞菌酵米面亚种(Pseudomonas cocovenenans subsp. farinofermentans)是我国学者于1977年发现的一种食源性致病菌,该菌可产生米酵菌酸(BongkrekicAcid, BA)和毒黄素(Toxoflavin),能引起高致死性的食物中毒。近些年来国内对该菌的研究较少,之前的研究集中于该菌的培养、鉴定、分类及毒素的产生等,针对该菌的分型技术还不完善。本研究通过API 20NE、VITEK 2 GN、16SrDNA序列分析对椰毒假单胞菌酵米面亚种分离株进行鉴定,在此基础上使用脉冲场凝胶电泳(Pulsed-Field Gel Electrophoresis,PFGE)和荧光标记扩增片段长度多态性(Fluorescent Amplification Fragment Length Polymorphism,FAFLP)方法对鉴定明确的菌株进行分子分型,结合菌株流行病学资料建立椰毒假单胞菌酵米面亚种的溯源数据库。1.椰毒假单胞菌酵米面亚种的生化鉴定、培养特征及毒性试验使用两种商品化生化鉴定系统对78株国内分离株及4株伯克霍尔德氏菌参考菌株进行生化鉴定及生物分型。API 20NE与VITEK 2 GN将82株菌分别分为23个和44个生化类型,分别以93%和85%的相似度为界分为8个群。API 20NE结合补充试验将93.6%的分离株( 73/78 )鉴定为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli);VITEK 2 GN 将 80.8%和鉴定为B.gladioli( 63/78),16.7%的分离株(13/78)鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌(B.cepacia),比API 20NE具有更多生化反应多样性。生化反应结果不稳定,且生化特征易受菌株状态影响,不适合用于细菌分型。以国标4789.29-2003为参考,对菌株进行培养特征的描述及部分菌株产毒性能的初步确定。实验结果显示,脑心肉汤浸液(BHI)、银耳液和马铃薯葡萄糖液均可用于椰毒假单胞菌酵米面亚种纯菌的增菌;银耳液或马铃薯葡萄糖液可在定程度上抑制杂菌生长。椰毒假单胞菌酵米面亚种在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中特征较为稳定。该菌在银耳卵黄琼脂中虹彩特征明显,适合对可疑菌株作初步筛选,但在SS培养基中特征不统一,不适合该菌培养特征描述。对25株分离株进行产毒试验,其中7株产毒试验阴性,18株产毒试验阳性,产毒阳性率较高。通过与历史数据的比较发现菌株的产毒能力并不恒定,可能与多次传代培养或培养基的改变有关。菌株产毒和毒力变化的机制及产毒能力能否恢复仍不明确,有待进一步探讨。2.椰毒假单胞菌酵米面亚种16S序列分析对78株国内分离株进行16S rDNA序列测定,将获得的序列与NCBI中的nr/nt核酸库进行BLAST比对行鉴定,并通过BioNumerics软件进行聚类分析,在此基础上进行多重比对,用最小简约法构建系统发育树。分析结果显示,BG 10和BG 12鉴定为短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)外,其他菌株均鉴定为Burkholderia属,其中74株分离株均鉴定为B.gladioli,BG 63和BG 64鉴定为洋葱伯克霍尔德氏菌群(B.cepacia complex)。74株B.gladiol分离株的16SrDNA序列相似度均在99.5%以上。由于16S rDNA序列的保守性,无法对菌株进行较好分型,但可通过序列之间的差异计算菌株间的进化距离。系统发育树中,B.gladioli、B.cocovenenans、P.antimicrobica、B.plantarii、B.glumae构成一支,包括所有鉴定为B.gladioli的分离株。根据细菌命名原则,应将椰毒假单胞菌酵米面亚种划为B.gladioli。3.椰毒假单胞菌酵米面亚种分子分型使用限制性内切酶Spe Ⅰ对鉴定为B.gladioli及B. cepacia comlex的76株分离株及4株Burkholderia参考菌株酶切后进行PFGE分型。80株菌可分为67种带型,以71%为界分为10个群,PFGE方法可对椰毒假单胞菌酵米面亚种进行良好的分型。图谱完全一致的菌株均分离自相同地点,其中BG58-BG 59分离自同一地点不同食品;但分离自不同地区、无流行病学相关性的BG 07-BG 19、BG76-BG79、BG67-BG77相似度均≥94.7%。因此,单酶切PFGE方法虽然具有较高的分辨率和重复性,可用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的溯源,但需结合其他试验和流行病学资料进行综合判断。使用4种低频酶与2种高频酶进行FAFLP,根据电泳结果选择限制性制性内切酶组合及选择性碱基,筛选出Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G和Pst Ⅰ-T/Taq Ⅰ-G两种方案。Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G将80株菌分为77个型,以92%为界将菌株分为20个群;Pst Ⅰ-T/Taq Ⅰ-G将80株菌分为78个型,以87%为界分为13个群。Apa Ⅰ-G/Taq Ⅰ-G和Pst Ⅰ-T/Taq Ⅰ-G分型的辛普森多样性指数D(Simpson Diveresty Index)分别为0.9987和0.9994,两种方案对椰毒假单胞菌酵米面亚种均具有较好的分型能力。在FAFLP的组合图谱中,除分离自同一中毒事件的BG 65和BG 66带型完全一致外,其他菌株均有不同程度差异。分离自同一地点的部分菌株图谱相似度≥94%,而分离自不同地点的菌株普遍差异较大。因此,FAFLP方法可用于椰毒假单胞菌酵米面亚种的溯源分析中。PFGE与FAFLP分子分型方法对椰毒假单胞菌酵米面亚种均具有较强分型能力,且各具优点,与FAFLP相比,PFGE操作简单易于标准化,而FAFLP具有更多的方案选择且分型通量高。4.椰毒假单胞菌酵米面亚种溯源数据库的建立利用表型特征和分子分型技术对保藏的椰毒假单胞菌酵米面亚种分离株进行鉴定和分型,采用BioNumerics软件对分型数据进行分析,结合菌株背景信息,建立比较完整的椰毒假单胞菌酵米面亚种的溯源分析数据库。利用该数据技术基础和不断完善的数据库信息,为椰毒假单胞菌酵米面亚种食物中毒和常规监测中的追踪和溯源等提供有效的数据资料,服务于食源性疾病的预防控制和常规监测。对具有流行病学背景的50株菌进行综合分析后,可以明确椰毒假单胞菌酵米面亚种 BG65-BG66、BG41-BG42-BG43、BG 13-BG 14、BG58-BG59、BG68-BG 75具有明显的相关关系,其他菌则不能证明具有明显相关关系。溯源数据库必须以准确的实验数据为基础,并根据流病病学资料作出合理解释。