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IFN-γ是由机体内活化的T淋巴细胞和NK细胞产生的一种糖蛋白,丝裂原以及抗原特异性刺激的T细胞克隆也可产生和分泌。IFN-γ除具有抗病毒、抗胞内寄生菌、抗胞内寄生原虫、抗细胞增殖的作用外,还具有独特而强大的免疫调节功能,可促进MHCⅡ类抗原的表达,增强APC与T细胞的相互作用,增强Th细胞和CTL转化的能力等。IFN-γ有较为严格的种属特异性,不同物种之间通用使其活性降低或失去作用。IFN-γ活性形式为两条单体链结合形成的同型二聚体形式,单体没有生物学活性。IFN-γ作为机体免疫应答的产物,一方面是机体发挥免疫功能,清除胞内寄生病原体不可缺少的成分,与疾病的发生、发展有着密切的关系;另一方面,机体内IFN-γ分泌过量,可引起病理性反应。由于IFN-γ具有上述诸多重要的生物学活性,故其在疾病的诊断、治疗和预防等方面具有广阔的应用前景。但是,IFN-γ在临床应用时可引起发热、寒战、恶心等一系列的副作用,而且有些不良反应是不可逆的损害,这限制了其在临床中的应用。因此,开展新型、低毒副作用的pIFN-γ研究意义重大。此外,IFN-γ必须与受体相结合,通过受体的介导才能发挥其生物学效应,对其受体的研究将有利于明确IFN-γ的作用机制,进而发现疾病治疗和预防的新途径。本论文在对克隆的pIFN-γ基因进行适当的改造,去除其信号肽序列,将该基因与pGEX-4T-1载体上的谷胱甘肽S-转移酶(GST)拼接,然后在原核表达系统中进行表达,并对其诱导表达条件、蛋白纯化方法进行系统研究,最终获得了纯度高达95%的GST-pIFN-γ融合蛋白,产量为0.4~0.5g/L培养液。体外试验证实该重组蛋白具有较高的生物活性,可有效抑制PRV(DNA病毒)和FMDV(RNA病毒)的复制,并且具有稳定、不宜降解和低毒副作用的优点。开展了重组pIFN-γ体外抗弓形虫研究,结果表明pIFN-γ可诱导猪腹腔巨噬细胞产生抗虫作用,且随pIFN-γ量的增加抗弓形虫作用越明显,但任何浓度的重组pIFN-γ对弓形虫入侵PK15细胞无明显影响。对pIFN-γ诱导永生化细胞(PK15细胞)凋亡的作用及其对细胞端粒酶的影响进行了研究,结果发现在高浓度pIFN-γ的长时间诱导下,PK15细胞端粒酶显著下降,因此PK15细胞(肿瘤样细胞)发生凋亡,具体表现为细胞变圆脱落,DNA出现典型的“梯状带”,荧光染色可发现细胞核固缩,有凋亡小体出现;但如果用低浓度pIFN-γ进行诱导作用,PK15细胞端粒酶明显升高;该研究结果为IFN-γ临床治疗肿瘤提供了理论依据和指导。以表达纯化的GST-pIFN-γ作为抗原免疫BALB/C小鼠,取其脾细胞和SP2/0细胞融合,再经纯化的GST-pIFN-γ和的带组氨酸标签pIFN-γ作为包被抗原进行筛选,最终获得2株分泌pIFN-γ单抗的杂交瘤细胞株,经鉴定这两株单抗抗体亚类均属于IgG2a,轻链为κ型,对杂交瘤细胞株的染色体组型、单抗的稳定性及其识别的抗原位点等进行分析,结果证明所获2株单抗均表现稳定,可满足常规实验的要求。在对不同动物IFNGR两条链基因序列比对基础上,选择保守区段作为引物;然后分离猪外周血淋巴细胞,经刺激后提取细胞总RNA,应用RT-PCR方法克隆了猪IFNGR两条链基因,序列测定表明猪IFNGR1基因ORF为1413bp,共编码470个氨基酸;猪IFNGR2基因ORF为1110bp,共编码369个氨基酸。对不同物种IFNGR序列比较发现,不同物种间的差异比较大,据此推测这可能是IFN-γ种属特异性的重要原因之一。然后利用分子生物学软件对两条链进行结构预测,设计引物扩增猪IFNGR胞外区片段并对其进行原核表达,经鉴定该基因在原核中得到正确表达;开展了两条受体链胞外区对pIFN-γ抗病毒活性的影响研究,发现猪IFNGR1胞外区可降低pIFN-γ抗病毒活性,而IFNGR2胞外区可增强pIFN-γ抗病毒活性,由此可知猪IFNGR两条链均可结合pIFN-γ;此外,推测猪IFNGR1具有信号转导功能且是IFN-γ信号转导的主要执行者,而IFNGR2则在IFN-γ信号转导中起次要作用或没有信号转导的能力。