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核苷类抗生素是一类结构新颖多样,生物活性显著的重要天然产物,多氧霉素(polyoxin,POL)与衣霉素(Tunicamycin)便是其中的重要代表性抗生素。多氧霉素对农作物、果蔬及一些经济植物真菌病害有良好的防治作用,加之其对环境友好,所以自创制成功以来,便在农业生产上大规模的推广应用。迄今为止,多氧霉素仍是我国乃至世界上投产与使用最广泛且未产生耐药性的农用抗生素之一。多氧霉素的化学结构由核苷骨架及两个后修饰的氨基酸组成,由于其化学结构与真菌细胞壁中几丁质的合成单元N-乙酰葡萄糖氨的结构相似,所以多氧霉素是几丁质合成酶的强烈竞争性抑制剂,故而展示出高效的广谱抗真菌活性。本研究旨在从分子水平上阐明多氧霉素独特的生物合成机理,从而为利用途径工程策略对多氧霉素产生菌进行分子改良以获得其高产菌株(有效组分高产菌株),同时也为利用组合生物学手段产生具有更高生物活性的多氧霉素衍生物奠定坚实的理论基础。
前期研究从工业菌株(S.aureochromogenes)中克隆出多氧霉素生物合成基因簇,序列分析显示,其与&.cacaoi中的多氧霉素生物合成基因簇高度同源。为便于系统研究多氧霉素的生物合成机理,本研究以S.Aureochromogenes为出发菌株,利用遗传学方法缺失多氧霉素生物合成基因簇,并利用多氧霉素生物合成簇缺失突变株为宿主结合异源表达策略,初步分析并表征了参与多氧霉素核苷骨架合成的相关基因。
前期研究显示,PolB与链霉菌中胸苷酸合成酶ThyX表现为较高的同源性,其与多氧霉素核心结构的甲基化修饰直接相关,并也可参与初级代谢中dTMP的生物合成。通过多学科研究显示,PolB蛋白中的两段loop与底物识别的双功能性密切相关,进一步的分子拉伸动力学结果也支持了此前实验结果,说明PolB为自然界中独特的双功能UMP/dUMP甲基转移酶。
衣霉素(Tunicamycin)为核苷类抗生素,由教酒链霉菌NRRL3882(Streptomyces charteusis NRRL3882)等多株放线菌产生;由于其化学结构新颖、生物活性显著,一经发现便备受瞩目,并广泛应用于细胞生物学研究。衣霉素的化学结构由尿嘧啶、N-乙酰葡萄胺、11-碳糖(衣霉胺)及N-脂肪链四个构造单元组成(图1);就结构而言,天然产生的衣霉素家族抗生素的区别主要在于N-脂肪链及碱基(尿嘧啶或二氢尿嘧啶)的变化。利用高通量异源表达策略结合生物测定方法,从教酒链霉菌NRRL3882基因组文库中克隆出衣霉素的生物合成基因簇(图3),生物信息学分析显示,衣霉素整个生物合成基因簇含有9个结构基因,3个抗性基因;以此为基础结合遗传学分分析,进而成功推断出衣霉素的整个生物合成途径。