针对临床样本的蛋白质分析对于攻克癌症、心血管疾病、糖尿病等攸关人类健康的重大生物医学难题具有至关重要的推动作用。蛋白质作为分子水平上生物学功能的主要承载者,其表达与活化时刻受到细胞信号转导网络的严密调控,表现为特异性的亚细胞定位、时序上严谨的激活与失活等,而在疾病等非正常状态下,蛋白质表达与活化水平则出现异常波动,表现出各种疾病的发生、病程的进展。目前,大量临床案例建立了许多疾病特异性的标志蛋白,因此,针对疾病标志蛋白的快速、准确、灵敏定量分析,对于肿瘤等疾病的早期筛查与及时干预,疾病的准确分期、分级以及对症施治等临床实际问题,具有重要价值。经典的蛋白质分析利用抗体识别靶标蛋白,但是进一步提高蛋白质定量分析的灵敏度、选择性和准确性,则不可避免地牵扯到位点特异性共价衍生,甚至是密码子拓展等较为复杂的蛋白质工程技术。为寻找高效而低成本的蛋白质分子识别与传感技术,近年来核酸等结构更加简单、易于人工合成的靶向结合配体逐渐应用于蛋白质定量的研究。另一方面,由于抗体免疫反应的化学本质在于少数可变区多肽与靶蛋白的特异性接触,因此,本论文工作尝试利用多肽作为构建分子识别的骨架,借助多肽与蛋白质、核酸、药物小分子、金属离子等多样化的相互作用,实现了蛋白质特异性识别和信号放大发生;而且,基于这些设计方案所提出的蛋白质定量新方法已经初步应用于临床样本中疾病标志蛋白的检测。具体内容如下:1、基于多肽-瓜环超分子作用的蛋白质定量新方法芳香氨基酸的侧链基团与带有电化学活性的芳香杂环分子可同时被八元瓜环这一合成大环分子借由“主-客”包络作用而非共价地结合在一起;同时,许多“多肽-蛋白质”分子识别依赖芳香氨基酸的疏水相互作用,因此,我们设计了包含芳香氨基酸的蛋白质靶向多肽探针,并通过芳香氨基酸的这类超分子作用而对探针进行非共价的信号标记并产生信号输出,从而提出了基于多肽的蛋白质定量新方法。此外,我们还进一步将瓜环所包络的电化学信号分子替换为具备光化学活性的催化信号标签,从而使检测灵敏度提高到非小细胞肺鳞癌临床样本检测所需的水平。2、基于多肽折叠与多肽纳米结构的蛋白质定量新方法多肽发生分子识别的同时,可进行构象的变化、折叠,甚至组装、聚集形成纳米结构,我们基于这一特性首先利用淀粉样肽的组装和聚集作为信号放大发生的手段,实现了前列腺癌多种蛋白酶标志物的临床样本分析,继而为β淀粉样肽设计了构象传感器,利用分子识别时构象变化影响界面电化学信号传递的动力学,并借助电化学扫描的频率调谐获得了理想的信号增益。此外,我们还利用人工设计的多肽形成类似细胞外基质的纳米网络结构,从而实现了肝细胞癌中潜在蛋白酶标志物的临床样本检测。3、基于多肽功能模体的蛋白质定量新方法许多多肽序列通过与配体分子的结合而成为具有分子识别、催化等生物活性的多肽功能模体。因此我们利用仅三个氨基酸的铜离子结合肽作为催化模体,并且与靶标蛋白的靶向识别模体相组合,从而设计了兼具分子识别和信号催化放大功能的双功能多肽探针。同时,通过铜络合肽催化的氧化反应所产生的大量电化学活性信号分子,使检测的灵敏性满足在临床样本中分析细胞骨架调控蛋白的需要。4、基于多肽与小分子探针联合使用的蛋白质分析新技术将小分子探针与多肽联合使用可提高多肽传感器对靶标蛋白的亲和力及对蛋白表面特殊活性位点的识别能力,因此,我们利用多肽探针识别靶标蛋白,并利用具有化学反应选择性的小分子探针识别并共价结合靶标蛋白表面的特殊修饰氨基酸侧链,实现了蛋白质硝基化翻译后修饰的检测,并应用于复杂细胞样本中p53等调控蛋白生物活性的分析。同时,通过对小分子探针进行改性、与蛋白质大分子交联,利用改性探针进一步分析了蛋白质翻译后修饰的计量数与蛋白质功能状态的关系。此外,我们还利用靶向小分子修饰多肽探针,获得了靶向癌细胞表面恶变转移标志蛋白的特异性探针,并将探针与多肽修饰的纳米信号标签联合使用,用于分析肿瘤细胞的恶性程度。5、临床蛋白质分析中的初步应用本论文工作所提出的蛋白质定量新方法已初步应用于临床样本中一些疾病标志蛋白的检测分析,比如,与晚期恶性肿瘤转移相关的各类转录调控因子、细胞骨架和细胞外基质蛋白的表达量及生物活性分析等等。同时,为了达到临床样本检测的需要,蛋白质传感体系中还设计了多种信号放大策略,以提高检测灵敏度并降低临床样本中复杂成分的干扰,因此,在肺癌、肝细胞癌和乳癌的肿瘤组织样本中,可以检测到标志物含量或活性与癌症进展的平行关系,且与经典病理分析所得的肿瘤分期、分级及复发转移情况相符合,而在前列腺癌样本的检测中还以多种标志物的联合使用,可为病患病情分组提供有益的参考。