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背景:肝细胞癌(Hepatocelluar carcinoma,HCC)发生迅速,恶性程度非常高,预后极差。虽然目前肝癌的治疗手段不断进步,但每年仍有约75万人死于HCC。因此,揭示其潜在发病机制对于提高治疗效率尤为重要。研究发现多种长链非编码RNA(Long non-coding RNAs,lncRNAs)在肝癌中表达失调,其异常表达与肿瘤相关。目前已有研究报道lncRNA-结直肠肿瘤差异表达基因(colorectal neoplasia differentially expressed,CRNDE)在HCC中表达升高,但是其在HCC中的作用及具体分子机制尚不十分明确。目的:1.明确CRNDE在HCC中的作用。2.明确CRNDE与邻近基因IRX5的关系以及IRX5的生物学功能。3.阐明CRNDE调控IRX5的表达而行使其生物学作用的分子机制。方法:第一部分:CRNDE在肝癌中的表达及其生物学功能研究1.FISH技术检测CRNDE的定位情况。2.QRT-PCR检测肝癌组织和肝癌细胞系中CRNDE的表达。3.在肝癌细胞中转染CRNDE过表达质粒和感染sh-CRNDE慢病毒。克隆形成、MTS检测过表达或干扰CRNDE对肝癌细胞增殖的影响。划痕愈合实验和Transwell检测迁移和侵袭能力。4.构建CRNDE过表达和干扰稳定株。皮下移植瘤实验检测两种稳定株在体内的生长情况。5.肝脏原位种植瘤实验和HE染色检测两种稳定株在体内的转移情况。第二部分:CRNDE与邻近基因IRX5的相关性及IRX5的生物学功能研究1.在肝癌细胞中转染pcDNA3.1-CRNDE质粒和感染sh-CRNDE慢病毒,qRT-PCR和western blot检测过表达或干扰CRNDE对IRX5mRNA和蛋白水平的影响。2.在过表达CRNDE基因诱导的裸鼠转移模型的肝脏及肺组织中,IHC检测IRX5的表达情况。3.QRT-PCR检测肝癌组织和肝癌细胞系中IRX5mRNA水平。4.Western blot检测肝癌组织和肝癌细胞系中IRX5蛋白水平。5.在肝癌细胞中转染pcDNA3.1-IRX5质粒和感染sh-IRX5慢病毒,MTS检测IRX5对细胞增殖的影响;Transwell检测IRX5对细胞迁移和侵袭的影响。第三部分:CRNDE调控IRX5的分子机制研究1.生物软件预测与CRNDE结合的miRNAs;以及与IRX5-3’UTR结合的miRNAs。在SMMC7721细胞中转染pcDNA3.1-CRNDE质粒,qRT-PCR检测过表达CRNDE对miRNAs的影响。2.在肝癌细胞中转染pcDNA3.1-CRNDE质粒和感染sh-CRNDE慢病毒,q RT-PCR检测过表达或干扰CRNDE对miR-136-5p的影响。3.在肝癌细胞中转染miR-136-5p mimic和miR-136-5p-inhibitor,qRT-PCR检测过表达和干扰miR-136-5p对CRNDE的影响。4.QRT-PCR检测肝癌组织和肝癌细胞系中miR-136-5p的表达。5.在肝癌细胞中转染miR-136-5p mimic和miR-136-5p-inhibitor,MTS检测miR-136-5p对细胞增殖的影响。Transwell检测迁移和侵袭能力。6.在肝癌细胞中共转染miR-136-5p mimic和pcDNA3.1-CRNDE,MTS检测miR-136-5p是否影响CRNDE对细胞增殖的作用;Transwell检测miR-136-5p是否影响CRNDE对细胞的迁移与侵袭的作用。7.在293T和SMMC7721细胞共转染miR-136-5p mimic和PGL3-CRNDE载体,荧光素酶检测miR-136-5p对PGL3-CRNDE活性的影响。8.在肝癌细胞中转染带有生物素标记的miR-136-5p-inhibitor,采用RIP实验检测AGO2抗体富集CRNDE的情况。9.在肝癌细胞中分别转染miR-136-5p mimic和miR-136-5p inhibitor,q RT-PCR和western blot检测过表达或干扰miR-136-5p对IRX5 mRNA和蛋白水平的影响。10.在293T和SMMC7721细胞共转染miR-136-5p mimic和PGL3-IRX5-3’UTR载体,荧光素酶检测miR-136-5p对活性的影响。11.在肝癌细胞中共转染pcDNA3.1-CRNDE和miR-136-5p inhibitor;或者共转染pcDNA3.1-CRNDE和miR-136-5p mimic,qRT-PCR和western blot检测过表达或抑制miR-136-5p对CRNDE调节IRX5的影响。结果:第一部分:CRNDE在肝癌中的表达及其生物学功能研究1.CRNDE定位于细胞核。2.CRNDE在肝癌组织和肝癌细胞系中表达上调。3.过表达CRNDE促进肝癌细胞的功能,干扰CRNDE抑制其功能。4.在裸鼠体内,过表达CRNDE促进肝癌细胞的生长;干扰CRNDE抑制其生长。5.裸鼠肝脏原位种植瘤实验和HE染色发现过表达CRNDE诱导的肝脏转移模型中,发生了肝内转移和肺转移,而干扰CRNDE未见转移。第二部分:CRNDE与邻近基因IRX5的相关性及IRX5的生物学功能研究1.QRT-PCR和western blot检测发现过表达CRNDE上调IRX5的IRX5mRNA和蛋白表达,干扰CRNDE抑制IRX5 mRNA和蛋白的表达。2.在过表达CRNDE诱导的裸鼠转移模型中,发生转移的肝脏及肺组织中的IRX5表达也上调。3.肝癌组织和肝癌细胞系中IRX5m RNA表达升高,其表达与CRNDE正相关。4.肝癌组织和肝癌细胞系中的IRX5蛋白水平升高。5.过表达IRX5促进肝癌细胞的功能,干扰IRX5抑制其功能。第三部分:CRNDE调控IRX5的分子机制研究1.生物软件预测到8个miRNAs,qRT-PCR检测发现miR-136-5p表达下调(P<0.01),其它miRNAs没有显著差异。2.过表达CRNDE使miR-136-5p的表达下调,干扰CRNDE使miR-136-5p的表达上调。3.过表达miR-136-5p使CRNDE的表达下调,抑制miR-136-5p使CRNDE的表达上调。4.MiR-136-5p在肝癌组织和肝癌细胞系中表达下调。5.MiR-136-5p mimic抑制肝癌细胞的功能,miR-136-5p inhibitor促进其功能。6.MiR-136-5p mimic抑制CRNDE的生物学功能。7.MiR-136-5p mimic抑制PGL3-CRNDE载体的荧光素酶活性,而对PGL3-CRNDE-Mut载体的荧光素酶活性没有抑制作用。8.RIP实验发现AGO2抗体能够富集AGO2蛋白,而Ig G阴性对照组不能富集AGO2蛋白。AGO2抗体组富集的CRNDE的表达量较Ig G对照组明显升高,转染miR-136-5p-inhibitor后,AGO2富集CRNDE的量明显下降。9.QRT-PCR和western blot检测发现过表达miR-136-5p抑制IRX5mRNA和蛋白的表达,抑制miR-136-5p上调IRX5 mRNA和蛋白的表达。10.MiR-136-5p mimic抑制PGL3-IRX5-3’UTR载体的荧光素酶活性,而对PGL3-IRX5-3’UTR-Mut载体的荧光素酶活性没有抑制作用。11.在肝癌细胞中共转染pcDNA3.1-CRNDE和miR-136-5p inhibitor;或者共转染pcDNA3.1-CRNDE和miR-136-5p mimic,qRT-PCR和western blot检测发现过表达miR-136-5p抑制CRNDE对IRX5的上调作用。结论:在本研究中,我们发现CRNDE定位于细胞核,CRNDE和其邻近基因IRX5在肝癌组织及细胞系中表达均升高。CRNDE和IRX5增强肝癌细胞的功能。MiR-136-5p在肝癌中表达下调。MiR-136-5p抑制肝癌细胞的功能。CRNDE与miR-136-5p存在相互反馈调节作用。MiR-136-5p可以直接结合到CRNDE序列中的结合位点。CRNDE与miR-136-5p作用可能发生在RISC复合体,并且通过AGO2与miR-136-5p作用。MiR-136-5p直接靶向IRX5。MiR-136-5p参与CRNDE调节IRX5的表达。CRNDE可能作为MiR-136-5p的内源性竞争RNA调节IRX5的表达,增强肝癌细胞的增殖和迁移功能。