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南方根结线虫(Meloidogyne incognita)是一种重要的植物寄生线虫,造成我国农作物产量的严重损失。研究南方根结线虫的分子致病机制可为寻找新防治靶标提供理论依据。本文以编码南方根结线虫类毒液过敏原蛋白(venom allergen-like protein,VAP)基因 MiV901 和 MiV52、分支酸变位酶(chorismate mustase,CM)基因 Mi-CM1和Mi-CM3为研究对象,利用农杆菌介导的烟草叶片瞬时表达技术,探究这四种效应蛋白在植物细胞中的定位;以基因Mi V901为研究对象,利用酵母双杂技术筛选出MiV901蛋白在拟南芥中的互作靶标蛋白,初步探明了M V901基因在寄生拟南芥过程中的功能。主要结果如下:1.南方根结线虫四种效应蛋白的亚细胞定位观察以南方根结线虫cDNA为模板,扩增了分支酸变位酶Mi-CM1和Mi-CM3、类毒液过敏原蛋白MiV901和MiV52的无信号肽序列片段,利用Gateway技术经BP反应和LR反应将目的片段构建到植物表达载体pK7FWG2中。利用农杆菌介导法在烟草叶片上分别瞬时表达 Mi-CM1Asp、Mi-CM3△sp、MiV901△sp和MiV52△sp。Western blot检测到上述4种效应蛋白与GFP融合后分子量大小相一致的条带,表明4种效应蛋白与GFP的融合蛋白均能在烟草叶片中正常表达。共聚焦显微观察显示,Mi-CM1△sp和Mi-CM3△sp均定位于植物细胞质和细胞核中,但在植物细胞的质体中未检测到荧光信号;MiV52△sp定位于植物细胞质和细胞核中,而MiV901△sp则定位在植物细胞质,细胞核未检测到荧光信号。2.MiV901调控番茄Cf-2/Rcr3pi介导的防卫反应测试为探究MiV901是否和马铃薯金线虫的同源蛋白Gr-VAP1具有类似的调控植物免疫机制,采用农杆菌介导的瞬时表达法测试MiV901能否诱发Cf 2/Rcr3pim介导的番茄HR反应,同时利用酵母双杂交技术对MiV901和Rcr3pim的物理互作进行了测定。结果表明,瞬时表达MiV901不能激发Cf 2/Rcr3pim番茄的HR反应,而注射了 Gr-VAP1和Avr2农杆菌转化子的番茄叶片均会出现坏死现象,酵母双杂一对一验证显示MiV901与番茄半胱氨酸蛋白酶Rcr3pim无直接物理互作。揭示了 MiV901的作用机制与Gr-VAP1有所不同,推测可能通过其他不同的作用靶标或方式在线虫寄生过程中发挥功能。3.酵母双杂筛选MiV901的植物互作靶标蛋白MiV901在前期研究中已证实与线虫致病性密切相关。为揭示MiV901在线虫寄生植物过程中的作用机制,本章利用MiV901诱饵载体,采用酵母双杂技术分别对番茄和拟南芥cDNA文库进行筛选,从番茄文库中共获得5个潜在的互作靶标蛋白,经一对一验证后证实均为假阳性;从拟南芥文库中共获得9个潜在的互作靶标蛋白,经验证后仅编码半胱氨酸蛋白酶At4g16190部分序列的克隆At5-2能在四缺平板生长,并能激活X-α-Gal报告基因的表达。进一步扩增At4g16190不含信号肽全部CDS序列并构建pGADT7酵母表达载体,一对一验证显示pGADT7::At4g16190与pGBKT7::MiV901共转化酵母菌株后,无法在四缺培养基上生长。