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叶片适度卷曲有利于水稻产量的提高。迄今在水稻中尚未见卷叶基因克隆及功能分析的报道。作为重要的粮食作物及基因组最小的单子叶植物,水稻在经济上及植物功能基因组研究上的重要性都是不言而喻的。因此,克隆卷叶基因可为水稻超高产育种卷叶基因的利用奠定基础,相关研究也可为卷叶的分子控制机理乃至叶片发育机理的阐明奠定基础。
本研究从6~Co-~射线辐照籼稻品系青华占(Qinghuazhan,简称QHZ)干种子的M2代中获得一个稳定的卷叶突变体y-ri,对其进行遗传学分析,并对其突变座位进行了分子遗传图谱和e-.物理图谱定位,以及对定位区段内的预测基因(ORFs)进行了遴选,为卷叶基因的克隆和功能分析奠定了坚实的基础。本研究主要获得的结果如下:
1通过C06~-~射线辐照处理QHZ干种子,从M2代获得一个全株叶片中度内卷,且能稳定遗传的卷叶突变体F-ri。遗传学分析表明,该卷叶突变体性状符合一对隐性基因控制的遗传模式。与IAA有关生物学特性初步分析的结果表明,突变体内源游离IAA含量比原种降低。
2以y-ri为母本、广亲和品种02428为父本杂交,选取F2代中601个卷叶单株作为遗传作图群体进行分子标记初步定位分析,结果表明,位于水稻第3染色体短臂上的RM6829和RM3126分别位于y-ri的两侧,与y-ri座位的遗传距离分别为2.08cM和1.64cM。γ-rl,与目前已定位的水稻卷叶座位都不在同一染色体位置,故为一新的卷叶基因座,将其暂命名为rllo(o。进一步对突变座位进行精细定位,结果表明,距离rllo(t)座位最近的分子标记SNPl21679和InDel422395分别位于两侧,与rllo(t)座位的遗传距离分别为0.08cM和0.17cM,并且检测出2个与rllo(o座位零重组的分子标记SNP75346和SNPll0263。并构建了覆盖突变座位的e-物理图谱,最终将该座位定位于第三染色体的BAC克隆OJl607A12上约50kb的范围内。
3根据公共数据库的基因预测结果,在精细定位的约50kb范围内发现了4个开放阅读框(OpenReadingFrames,ORFs),即ORFl0、ORFll、ORFl2和ORFl3。通过PCR扩增、测序及分子杂交对预测基因(ORFs)进行遴选,排除了ORFl0、ORFl2和ORFl3作为rllo(t)候选基因的可能性,而ORFll基因在突变体中存在较大缺失,因此确定ORFll为唯一可能的候选目的基因,该基因编码黄素单加氧酶(Flavin-containingMonooxygenase,FMO),将其暂命名为OsFMOw。对突变体中ORFll位点附近区域的缺失状况进行分析,结果表明,ORFll及其上下游总长约7.5kb的片段在突变体中完全缺失,且突变体中基因组缺失的范围在12.98~16.47kb之间
4序列分析表明,OsFMOo)基因有4个外显子和3个内含子,且该基因的核酸序列在水稻中高度保守。预测的OsFMO(t)蛋白由422个氨基酸残基组成,含有FMO功能保守核心基序,并具备“GxGxxG”的特征结构。
5对水稻基因组内部的FMO同源基因进行了分析,结果表明,在水稻基因组内共有9个FMO同源基因,可分为两个亚家族,其中OsFMO(t)所在亚家族还有3个成员,它们编码的蛋白与与OsFMO(o蛋白具有58~65%的氨基酸残基相似性,而且与拟南芥等高等植物的FMO同源基因在进化上处于同一个分支。