禽流感(avian influenza,AI)主要是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种全身性或呼吸器官性传染疾病,其中高致病性禽流感具有致死率高、传播范围广等特点。目前,国际检验兽疫局(OIE)已将禽流感定为A类传染病,我国也将其列为一类动物疫病。禽流感属人畜共患病,它一旦爆发不仅给禽类养殖业用户带来巨大的经济损失,同时还会给公共卫生事业造成严重威胁,目前我国把对禽流感防控作为重要的任务。如何防控禽流感是一个长期而艰巨的任务,控制禽流感不仅需要将患者进行隔离,而且需要对动物进行早期的检测,做到及时切断动物方面的传播途径。目前,对于禽流感病毒的主要检测技术有禽流感病毒的分离与检测、血凝-血凝聚合酶抑制(HA-HI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、聚合酶链式反应(PCR)和免疫胶体金等。禽流感病毒的检测以及分离诊断相对比较准确,但是操作繁琐且比较耗时,不利于快速的检测;HA-HI试验对环境比较敏感,外界的条件会对检测结果产生影响;ELISA试验由于步骤简便,有利于大量病毒样品的分析检测,但其需反复洗涤,耗时且检测灵敏度有限;PCR这种方法虽然具有能够直接检出禽流感病毒的基因的功能,且检测灵敏度相对较高,但检测成本以及技术要求比较高,只适用于检测机构和实验室诊断,不适合现场快速诊断;针对于胶体金检测鉴定技术,目前已有相关产品被开发,但其检测灵敏度不高,产品质量不一,只能定性,不能定量,只能用于疫病的辅助检测。因此,针对于目前禽流感检测方法的一些局限性,探索一种高效、特异、准确、简便的检测手段对于禽流感的及时防控具有十分重要的意义。而现有的血清学检测方法主要基于抗原抗体的反应,目前国内禽流感病毒抗体产品质量参差不齐,国外已有比较成熟的商品化抗体,但价格十分昂贵。因此,制备高效价、特异性强、低成本的禽流感病毒单克隆抗体可为禽流感的检测鉴定与及时防控提供有效试剂。快速、低成本免疫检测对全球健康有重要意义,传统的免疫检测方法因过程繁琐等问题,无法于现场快速完成。而利用交流动电富集蛋白并基于阻抗免疫传感的方法操作简单,可将传统的ELISA的检验时间从数个小时缩短到1分钟之内,同时还具有非常低的检出限。该技术主要利用交流动电效应加快微粒操控芯片表面抗原抗体特异性结合,此时阻抗免疫传感器可实时监测芯片表面因抗原抗体结合所引起双电层厚度的变化从而判定阴阳性结果。该方法具有低成本、高灵敏度、覆盖面广等优点,有望用于临床疾病的即时检测(Point-of-care testing,POCT)。目前国外有文献报道将该技术用于双酚A(BPA),寨卡病毒RNA、革兰氏阴性菌、人体D-Dimer等的检测,均取得了理想的实验结果。前期本实验室已成功将该项技术应用于禽类新城疫病毒和布鲁氏菌病抗体的检测。而该技术应用于禽流感的检测尚未见报道。本研究拟采用原核表达系统制备H9N2 AIV血凝素(HA)蛋白,用HA蛋白作为免疫原对BALB/c小鼠进行了免疫,利用PEG1500细胞融合技术制备HA单克隆抗体。此外,以所制备的HA抗原、抗体作为禽流感诊断试剂原料,将制备的HA抗体加入经臭氧处理后的微电极芯片表面,臭氧处理可实现芯片表面改性过程,使得芯片电极表面形成大量羟基(-OH)从而增加芯片电极表面的亲水性,有利于抗体与之固定结合。另外,芯片表面从纳米尺度上可观察到起伏不平的表面,这也增加了抗体包被于芯片电极表面的面积。再对未结合位点进行封闭处理以减少非特异性结合,从而制得用于禽流感抗原检测的微电极芯片,将芯片与阻抗仪连接即可监测芯片表面免疫反应情况,初步建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感器相结合的禽流感抗原检测方法,并对方法进行评价,为禽流感的现场即时诊断提供了一种新的检测技术。本文的研究内容如下:(1)为了实现H9N2 AIV HA蛋白在原核表达系统中进行高效表达,根据GenBank发布的A/chicken/Gansu/2/99(H9N2)HA(ID=EF070733.1)基因序列,优化该密码子,化学方法合成HA全基因,并在合成HA基因的5’段和3’段分别重新设计酶切位点NcoI和酶切位点XhoI,使用DNA Ligation Kit将该HA片段连接转化到质粒载体pET28a(+)中,以构建重组质粒pET28a(+)-HA。再将pET28a(+)-HA重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态的细胞中,为了表达出大量的HA重组蛋白,对于诱导基因表达中各项的条件(包括温度、时间、诱导剂浓度)进行了优化。然后利用镍柱(His-tag)对HA重组蛋白进行分离纯化,纯化后的HA重组蛋白经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)以及蛋白印迹实验(Western-blot)对其进行初步的纯度和特异性分析;经二喹啉甲酸(BCA)法对HA重组蛋白进行浓度的测定。(2)将上述方法制备的H9N2 AIV HA蛋白对BALB/c小鼠进行常规免疫,取免疫后的小鼠血清通过ELISA检测的方法进行抗体效价的测定,取抗体效价达到融合要求的小鼠,分离小鼠脾脏并制成脾细胞悬液,与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)通过PEG1500进行细胞融合;建立间接酶联免疫吸附法(ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体,采用有限稀释法对阳性克隆细胞进行亚克隆,并从中筛选出可稳定分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株,将其扩大培养后取适量细胞注射至BALB/c小鼠的腹腔内以形成腹水,收集小鼠腹水并使用Protein A柱对其纯化,将纯化后的抗体进行生物特性(包括纯度、浓度、效价、特异性)鉴定。(3)建立并优化交流动电阻抗传感检测方法,并应用于禽流感病毒的检测。首先对芯片表面微电极清洗条件进行优化,然后对芯片进行臭氧化处理使表面带有亲水性的-OH等基团而利于禽流感抗体的固定,然后将纯化所得抗H9N2 AIV HA单抗包被于芯片表面并对抗体修饰芯片的浓度及时间进行优化,然后优化封闭时间后将芯片连接于阻抗仪检测禽流感抗原,并对阻抗仪检测电压及电流参数进行优化以获得最适用于检测禽流感抗原的条件。最后分别从其灵敏度、特异性、重复性对实验方法效果进行初步的评价。结果:(1)成功构建基因工程菌株pET28a(+)-HA/BL21(DE3),筛选得出了该基因工程菌最优蛋白表达条件,在30℃、IPTG添加终浓度为0.8mmol/L持续诱导6h,HA重组蛋白的表达量最大;经镍柱亲和层析纯化后的HA蛋白纯度较高,达到了电泳纯,此外经过Western-blot鉴定,63KD处存在与其预期蛋白大小完全相符的条带,表明HA蛋白得到成功表达。(2)在制备H9N2 AIV HA单抗的过程中,共进行了两次细胞融合试验,两次的融合率分别为86.7%与94.4%。初次检测阳性率分别为33.5%和86.75%。在对融合后的杂交瘤细胞株进行多次克隆化反复筛选后总共成功获得了3株能持续地分泌抗体的单克隆株,分别为1F10E7,2D10D10,5A10C3;亚型鉴定结果显示3株抗体亚型均为IgG1型;将1F10E7细胞扩大培养后注入BALB/c小鼠的腹腔制备小鼠腹水型单抗,收集小鼠腹水用ProteinA柱抗体进行腹水型抗体的纯化,SDS-PAGE电泳鉴定结果显示纯化后抗体达到了电泳纯,且经BCA法浓度测定其浓度可达到2.518mg/ml,制备所得HA单抗经Western-blot鉴定后证实能与H9N2 AIV HA抗原以及H9N2标准病毒特异性结合,而与NDV的F蛋白无反应,说明制备的HA单抗具有较好的特异性。(3)在建立并优化禽流感抗原的检测方法过程中,确定了最佳芯片清洗方法为异丙醇、无水乙醇、超纯水依次超声清洗10min;最优抗体修饰芯片条件为加入10μg/mL的HA单抗于37℃的恒温箱中连续孵育3h;然后加入封闭液1%superblock 25℃封闭30min;阻抗仪最佳电压及电流设置为100mV、100kHZ。包被HA单抗分别检测0.1、1.0、10、100、1000ng/mL重组HA抗原稀释液,结果表明该方法用于检测禽流感抗原最低可以检测到10ng/mL的HA抗原,此时检测结果较为稳定。芯片包被HA单抗后检测经荧光逆转录PCR(reversetran scription-PCR,RT-PCR)鉴定的H9N2阴阳性禽咽拭子样品,共检测12支阳性样品(每支样品平行检测3份)、6支阴性样品,此外还检测了4支新城疫病毒尿囊液样品,其中每支样品平行检测3份。与传统的荧光RT-PCR检测的方法结果相比,其检测结果的灵敏度(检出特异阳性率)的灵敏度可达97.2%,检测特异性(检出特异阴性率)的灵敏度可达96.7%,且这种新的检测方法与其他常见禽类的病毒样品检测无任何交叉性反应,检测的结果表明该方法具备有较的特异性和较好的可重复性。该检测方法有望在未来成为便携式的诊断技术,将包被于HA单抗的微粒操控芯片经保护剂处理后进行真空保存,检测时仅需连接靠一部比手机略大的阻抗仪设备,就可实现现场1分钟检测并立即报告检测结果。结论:本研究成功构建了H9N2 AIV HA蛋白基因工程菌pET28a(+)-HA/BL21(DE3),并通过研究筛选出HA蛋白的最佳蛋白表达条件,实现了HA蛋白在大肠杆菌中高效表达;对HA蛋白进一步的纯化后作为免疫原对小鼠进行常规免疫,经过细胞融合及亚克隆细胞筛选后,共筛选到3株具有持续分泌抗H9N2 AIV HA抗体能力的单克隆细胞株;将制备的抗原、抗体作为试剂原料,用于建立基于交流动电效应与阻抗免疫传感技术相结合的禽流感快速诊断方法,通过对该方法进行优化与评价后,证明该方法具有较高的灵敏度、特异性,且重复性良好,可用于禽流感的现场快速检测,为禽流感的及时防控提供了一种新的检测技术。