慢性肾衰竭在我国近年来的发病率有显著增高的趋势，是严重影响人类健康的疾病之一。目前已有大量的临床及实验结果表明肾间质纤维化在慢性肾脏疾病进展中具有重要作用，故有效地抑制肾间质纤维化可减缓肾脏疾病的进展。肾间质纤维化是多种慢性肾脏疾病进展至慢性肾衰竭的共同病理改变，由多种因素诱导而成，细胞增殖及表型转化均参与这一过程并发挥着重要的作用。肾小管上皮细胞表型转化(tubularepithelial-myofibroblasttransdifferentiation，TEMT)的概念由Strutz于1994年提出，并已被证实为肾间质纤维化的核心病理改变，其标志物为α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)。TEMT的发生机制较为复杂，与多种因素相关，单一途径阻断难以获得理想效果，故寻找具有多种生理效应、多途径抑制TEMT的药物对减缓其进展有重要作用。肾上腺髓质素(adrenomedullin，ADM)是1993年发现的一种生物活性多肽，已证实该物质分布于体内多个重要脏器及组织中，肾脏是ADM表达及分布较多的器官之一。ADM具有拮抗转化生长因子β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)、血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、抗氧化、抗炎等多种生理作用，可以拮抗多种脏器纤维化。TEMT进程中，最为重要的发生机制是转化生长因子-β的诱导作用，故推论ADM可通过调控TGF-β、抑制TEMT从而减轻肾脏损伤，其具体作用机制有待进一步探索。ADM尚未用于临床，中药抑制肾间质纤维化的作用是否与其相关？前期实验研究已证实化瘀涤痰通络中药——肾络通能通过抑制TGF-β1拮抗TEMT的进展，是否通过调控ADM而发挥作用尚不明确。本实验研究采用ADM基因部分敲除小鼠(+/-)，以单侧输尿管梗阻(UUO)方法复制肾间质纤维化模型，以醛固酮受体阻断剂依普利酮为对照药物，观察肾络通对野生及ADM基因敲除小鼠肾组织中α-SMA、TGF-β1、Ⅲ型胶原(collagentypeⅢ，ColⅢ)及ADM表达的影响，探讨化瘀涤痰通络中药抑制TEMT拮抗肾间质纤维化的作用机制及其与ADM的关系，为临床提供治疗思路和实验依据。　　 第一部分:化瘀涤痰通络中药对ADM基因敲除肾间质纤维化小鼠肾功能及肾脏组织形态学的影响　　 方法:野生及ADM基因敲除小鼠各20只均随机分为四组，即野生小鼠分为假手术组(WT-Shamgroup)、模型组(WT-UUOgroup)、依普利酮组（WT-UUOEgroup）及中药组（WT-UUOSgroup）四组;基因敲除小鼠同样分为假手术组（AMKO-Shamgroup）、模型组(AMKO-UUOgroup)、依普利酮组(AMKO-UUOEgroup)及中药组(AMKO-UUOSgroup)四组。除假手术组游离左侧输尿管但不结扎外，其余各组均行左侧输尿管结扎术。中药组给予化瘀涤痰通络中药肾络通27.6g/(kg.d)经口灌服;依普利酮组给予依普利酮混匀于饲料中按100mg/(kg.d)剂量食入。假手术组及模型组经口灌服与中药汤剂等剂量的生理盐水。观察一般情况，给药10天。于实验结束时，称重，断头取血，分离血清，分别测定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平;摘取左侧肾脏并称重，计算各组肾重/体重比值，进行肾脏组织HE、Masson染色，观察组织病理学改变。　　 数据资料以均数±标准差（(X)±s）表示，使用SPSS16.0forwindows统计软件进行统计，组间比较采用单因素方差分析。显著性差异水平以0.05和0.01为标准。　　 结果:　　 1.实验小鼠肾重/体重比值测定结果　　 野生及基因敲除小鼠的模型组、依普利酮组及中药组显著高于相应的假手术组（P均＜0.01），但各组之间差异无统计学意义（P均＞0.05）。(见Table1-1)　　 2.小鼠肾组织病理形态学检测结果　　 HE染色显示，野生及基因敲除小鼠中，假手术组未见明显异常。模型组可见肾小管扩张，肾小管上皮细胞水肿，部分坏死、脱落，炎性细胞在肾间质区广泛浸润。Masson染色显示，野生及基因敲除小鼠中，假手术组肾脏结构未见明显异常，小管基底膜完整，肾间质可见少量胶原成分。模型组肾组织间质胶原成分沉积显著增多，并呈条带状或灶状分布，且基因敲除小鼠重于野生小鼠。依普利酮组及中药组间质胶原成分较模型组明显减少，其中基因敲除小鼠较野生小鼠损伤为重。　　 3.肾功能检测结果　　 Scr及BUN测定结果显示，野生及基因敲除中各组小鼠的Scr及BUN值虽有差异，但无统计学意义（P均＞0.05）。　　 第二部分:化瘀涤痰通络中药对ADM基因敲除肾间质纤维化小鼠α-SMA的影响　　 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时留取肾脏，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化法检测各组小鼠肾脏α-SMAmRNA及蛋白的表达。统计学方法同第一部分。　　 结果:　　 1.肾组织α-SMAmRAN检测结果采用RT-PCR测定α-SMAmRNA在肾组织中的表达，结果显示，野生及基因敲除中的假手术组小鼠呈弱表达，模型组表达较相应的假手术组显著增强（P＜0.01;P＜0.01），且基因敲除模型组显著高于野生小鼠模型组(P＜0.05)。依普利酮组及中药组表达下调(P＜0.01;P＜0.01)。　　 2.肾组织α-SMA蛋白检测结果WesternBlot结果显示，野生及基因敲除小鼠中的假手术组肾组织α-SMA蛋白表达较弱，模型组表达明显增强，显著高于相应的假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，且基因敲除模型组显著高于野生小鼠模型组(P＜0.05)。依普利酮组及中药组表达明显低于相应的模型组(P＜0.01;P＜0.01)，中药组与依普利酮组无明显差异(P均＞0.05)。　　 3.肾组织α-SMA免疫组化检测光镜下野生及基因敲除小鼠的假手术组仅在血管平滑肌细胞表达，肾小球、肾小管及间质未见表达;模型组中α-SMA表达明显增多，多见于皮髓交界及皮质区的小管间质部分。基因敲除小鼠模型组表达尤其明显。依普利酮组及中药组α-SMA表达较模型组明显减少。但基因敲除小鼠表达较野生小鼠更为明显。　　 第三部分:化瘀涤痰通络中药对ADM基因敲除肾间质纤维化小鼠TGF-β1、ColⅢ的影响　　 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时留取肾脏，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化法检测各组小鼠肾脏TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表达，并用天狼猩红染色法测定肾脏胶原组织表达。统计学方法同第一部分。　　 结果:　　 1.肾组织TGF-β1、ColⅢmRNA检测　　 1.1TGF-β1mRNART-PCR测定结果显示，野生及基因敲除中的假手术组小鼠呈弱表达，模型组显著高于假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型组表达更为明显，显著高于野生小鼠模型组(P＜0.05);依普利酮组及中药组明显低于模型组(P＜0.05;P＜0.05)。　　 1.2ColⅢmRNART-PCR测定结果显示，野生及基因敲除中小鼠的假手术组呈极弱表达，模型组显著高于假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型组显著高于野生小鼠模型组（P＜0.01）;依普利酮组及中药组明显低于相应模型组小鼠(P＜0.01;P＜0.01)。野生及基因敲除小鼠之间比较，基因敲除小鼠中药组及依普利酮组表达均明显高于野生型同组小鼠(P＜0.05;P＜0.05)。　　 2.肾组织中TGF-β1及ColⅢ蛋白检测　　 2.1TGF-β1WesternBlot测定野生及基因敲除小鼠假手术组TGF-β1蛋白少量表达，模型组表达显著高于假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型组表达显著高于野生小鼠模型组(P＜0.01)。依普利酮组及中药组表达明显低于相应模型组(P＜0.01;P＜0.01)。　　 2.2ColⅢWesternBlot测定结果显示，野生及基因敲除小鼠假手术组少量表达，模型组显著高于相应的假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型组显著高于野生小鼠模型组(P＜0.01)。野生及基因敲除小鼠依普利酮组及中药组明显低于相应模型组(P＜0.05;P＜0.01)。野生及基因敲除两型之间比较，基因敲除小鼠中药组与依普利酮组均明显高于野生型的同组小鼠（P＜0.05;P＜0.05）。　　 3.肾组织TGF-β1及ColⅢ免疫组化检测　　 3.1TGF-β1免疫组化检测野生及基因敲除小鼠的假手术组肾脏TGF-β1呈弱表达，可见于肾小球及肾小管上皮细胞;模型组TGF-β1表达明显增强，其中基因敲除小鼠尤其显著;依普利酮组及中药组表达较模型组明显减少，但基因敲除小鼠较野生小鼠表达明显。　　 3.2ColⅢ免疫组化检测野生及基因敲除小鼠的假手术组肾脏可见少量表达，可见于肾小球及肾小管间质;模型组ColⅢ表达明显增多，以间质最为明显，其中基因敲除小鼠甚于野生小鼠;依普利酮组及中药组表达较相应模型组明显减少，但基因敲除小鼠较野生小鼠表达明显。　　 4.肾脏胶原组织天狼猩红染色测定假手术组肾间质可见胶原组织表达于肾小球、肾小管及间质，野生及基因敲除小鼠间无明显差异;模型组表达明显增多，主要见于肾小管间质，皮质及髓质表达均明显增强，ADM基因敲除小鼠表达尤为显著;依普利酮组及中药组表达较相应模型组明显减弱，但两组中ADM基因敲除小鼠较野生小鼠表达明显。　　 第四部分:化瘀涤痰通络中药对肾间质纤维化小鼠ADM表达的影响　　 方法:动物分组、模型复制、给药方法同第一部分，共10天。实验结束时留取肾脏，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫组化法检测各组小鼠肾脏ADMmRNA及蛋白的表达。统计学方法同第一部分。　　 结果:　　 1.肾组织ADMmRNA检测野生及基因敲除小鼠中假手术组均有表达，但基因敲除小鼠的表达明显低于野生小鼠(P＜0.01)。模型组显著低于相应假手术组(P＜0.01;P＜0.01)，其中基因敲除模型组明显低于野生小鼠模型组(P＜0.01)。依普利酮组及中药组ADM表达明显高于相应模型组（P均＜0.05）。　　 2.肾组织ADM蛋白检测野生小鼠假手术组ADM表达明显，基因敲除型假手术组表达减弱，与野生型有显著差异（P＜0.01）;模型组ADM表达显著低于相应假手术组（P＜0.01;P＜0.01），基因敲除模型组明显低于野生小鼠模型组(P＜0.01)。依普利酮组及中药组ADM表达明显高于相应模型组(P＜0.05;P＜0.05)。　　 3.肾组织ADM免疫组化检测野生小鼠假手术组ADM表达较为广泛，在皮质及髓质均有表达，且以髓质表达为明显，基因敲除小鼠假手术组表达较野生小鼠假手术组明显减弱;两模型组ADM表达明显减少，髓质部减少更为明显，且基因敲除小鼠较野生小鼠表达显著减少，在髓质部几无表达;依普利酮及中药组ADM表达较相应模型组增多，其中野生小鼠表达较基因敲除小鼠为多。　　 结论:　　 1.结扎单侧输尿管复制肾间质纤维化实验动物模型，肾间质胶原成分显著增多，其中ADM基因敲除UUO小鼠较野生小鼠更为明显。依普利酮及中药可抑制胶原沉积，抑制作用对野生小鼠更为显著。　　 2.肾间质纤维化实验小鼠肾脏TEMT标志物α-SMA表达较假手术组明显增多，其中基因敲除小鼠较野生小鼠为甚;化瘀涤痰通络中药及依普利酮可下调α-SMA在mRNA及蛋白水平的表达。　　 3.化瘀涤痰通络中药可下调UUO肾间质纤维化模型小鼠肾组织中TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表达，减少ECM沉积。　　 4.肾间质纤维化实验小鼠肾脏ADM表达较假手术组显著降低，化瘀涤痰通络中药可上调其表达，对野生小鼠ADM的上调作用显著强于基因敲除小鼠。　　 5.化瘀涤痰通络中药可上调UUO肾间质纤维化模型小鼠的ADM表达，下调TGF-β1水平，抑制TEMT，减轻肾间质纤维化程度。这可能是中医药防治肾间质纤维化的作用靶点之一。