2013年在中国长三角地区出现的一种新型H7N9亚型禽流感病毒（AIV）对感染的家禽呈现低致病性（LP）,但在2016年H7N9病毒变异后对家禽呈高致病性（HP）。H7N9不仅使家禽业遭受重创,而且也造成了至少5个流行波次人感染H7N9,导致30%-50%感染者的死亡,严重危害了公共卫生安全。2017年9月（第5波次末）开始全国范围内实施强制性H7N9疫苗免疫家禽的策略,不但显著降低了人感染H7N9病毒的案例,自2018年以来也逐渐分离不到LPH7N9病毒。然而,HPH7N9病毒仍然在家禽中持续流行。为了深度解析H7N9亚型禽流感病毒的遗传与演化规律,本研究对2013-2021年H7N9病毒分离株的遗传进化、选择压、抗原变异、适应性、平行进化、时空动力学,地理关联模式,动态重配模式,和群体流行适应性等进行了全面分析。1.H7N9亚型禽流感病毒的流行病学和遗传演化分析为了对H7N9病毒的遗传和进化特征进行系统性分析,本节研究收集了自2013到2021年公共数据库及本实验室的H7N9分离株信息,包括基因序列,分离时间、地点和宿主,经过数据清洗和整理,根据一定阈值去重后形成三个数据集,分别为2013-2019 年分离毒株的 cd99（n=454,阈值 99%）,cd999（n=1514,阈值 99.9%）,和 2013-2021年包含2019-2021 HP毒株的HP数据集（n=574）。首先,使用贝叶斯遗传进化分析病毒的种群动态数量变化,结果表明H7N9病毒的种群数量在波次5中达到顶点,并随后迅速下降。随着H7N9疫苗在家禽上的部署使用,H7N9病毒的种群规模不断减少,但自2018年后病毒种群规模一度急剧增加,并具有明显的季节性波动性。遗传进化速率和多样性分析表明,与外部基因相比,H7N9病毒内部基因的多样性更明显但进化速率却更低,表明H7N9的重配较多。此外,最大分支置信度树（MCC）的拓扑结构显示,自2019年以来HP H7N9的HA和NA基因进化树上分别各自形成了两个新的小分支,并不断扩大。自第5波以来,抗原位点或受体结合位点出现了一些氨基酸突变,并影响到了抗原性和受体结合特性。其中,通过交叉血凝素抑制（HI）数据分析绘制的抗原图谱（antigenic map）表明,H7N9病毒的抗原性在第7波中出现了明显的抗原漂移。同时,分子动力学模拟发现,HA受体口袋周围的突变（V135T、S145P和L226Q）增加了对禽源α2,3-SIA的亲和力,而降低了对人源α2,6-SIA的亲和力,表明HP H7N9变异可能加剧了对家禽的致病性,但减少了对公众健康的威胁,L226Q对受体-配体之间的结合自由能的变化贡献较大。HA的N-糖基化预测分析也表明,自第6波次以来,逐步新增了 123和149位的糖基化位点,并固定下来。对HP H7N9的HA基因的平行进化分析表明,多个重要位点处于平行和趋同进化中。选择压分析表明,H7N9病毒的表面基因自第5波以来受到强化选择（intensified selection）,疫苗接种可能加剧了病毒的自然选择。此外,地理关联性分析显示,HPH7N9病毒自2017年扩散至我国北方地区后,主要呈现局部流行和本地化的进化特征。尽管如此,对2021年云南省报道分离的HPH7N9病毒的时空动力学分析表明,HP H7N9病毒是在2020年10月从中国北部地区扩散到西南地区。通过系统的遗传进化和时空动力学分析,揭示了目前HP H7N9病毒在我国的遗传进化变异,抗原性与受体结合特性变化和地理分布特征,为HPH7N9病毒防控措施的制定提供了理论依据。2.H7N9亚型禽流感病毒动态重配分析第一章研究发现H7N9病毒内部基因的多样性高于外部基因,而多项研究也表明了H9N2病毒是H7N9病毒多次重配事件的内部基因供体。为了系统解析H7N9和H9N2病毒之间的动态基因重配,本章主要使用cd99数据集,基于系统发育分析对H7N9病毒的亚型间和亚型内重配模式展开了研究。一方面,对亚型间的重配研究发现,H7N9病毒与H9、H5、H6亚型流感病毒间呈现复杂和频繁的重配特征,但H7N9病毒主要、频繁地与H9N2亚型病毒之间发生重配,较少与其他禽流感病毒发生重配。然而,通过2019-2021年收集的数据分析发现,HPH7N9病毒已经拥有了一个独立于H9N2和呈优势流行的内部基因盒,并且自2017年以来与H9N2的重配事件逐渐减少。另一方面,对H7N9亚型内部的病毒重配进行了分析。首先,根据HA系统发育树的分型结果,将H7N9划分出5个长江三角洲谱系（YRD A-E）和2个珠江三角洲谱系（PRD A-B）的分支。同时也对其他7个片段进行分支划分。八基因缠绕树（tanglegramorincongruencetree）的分析结果表明,YRE-E中LP H7N9为第5波的主要流行分支,其中共同含有PB2 c05和M c02分支的病毒占据了该分支62.10%的毒株;同时部分YRD-C分支（HPH7N9）的病毒在第5波中从共同流行的YRD-E分支（LP H7N9）中获得了 PB2、PA和M片段,表明了频繁的YRD谱系内重配现象。片段间的重配度分析结果表明,HA与NA之间的重配度低于HA与其他六个片段。片段间的多维缩放（MDS）分析发现了 PB2和PA之间的存在较强的遗传关联性,表明它们存在着共同的遗传进化史。贝叶斯溯祖与重配网络分析（BEAST2/CoalRe）结果表明了在第2-3波和第5波中的HA与NA具有较高的亚型内和谱系间的重配事件发生。本节研究的重配研究结果表明H7N9病毒种群的高度遗传多样性是由频繁的重配所造成,并揭示了亚型间和亚型内不同的重配模式。复杂的重配模式和适应性突变共同塑造了 H7N9病毒的流行和进化。为了降低H7N9病毒因重配发生抗原转变并造成发生人际传播的风险,需要密切监测家禽中H7N9病毒重配模式和变异状况。3.低致病性H7N9亚型禽流感病毒的保守性进化与种群衰减分析第一章的病毒种群动态研究结果发现,LP H7N9病毒的种群和分离数量在大规模疫苗使用之前即呈现明显的下降趋势,且于2017年夏已降至较低水平。由于流感的快速适应性进化主要聚焦于HA蛋白,因此本章进一步基于HA基因（cd99和cd999数据集）的分子变异特征及其对病毒种群适应度的影响,对LP H7N9种群衰减的潜在因素进行解析。首先,通过对波次5期间主要流行的YRD-E分支中LP H7N9病毒的分离数量和分离地点进行统计分析,发现YRD-E是主要发生种群数量衰减的分支,在2018年后已消失。进化速率计算显示,分析数据集中HA基因的总体平均遗传进化速率为6.49×10-3,而YRD-E分支明显偏低,仅为3.95×10-3,提示该分支在进化上的相对保守性。通过主成分判别分析,发现波次5毒株HA基因遗传距离与前后波次之间相近。HA1抗原位点的汉明距离分析表明,YRD谱系病毒群体的抗原性在波次4-5时变化缓慢。氨基酸选择性扫描（Sweep Dynamics）分析发现YRD谱系在2015年后缺乏适应性氨基酸突变的出现。局部分支指数分析表明YRD-E分支的病毒种群的流行适应度普遍偏低。非同义与同义突变累积比率分析发现YRD-E分支的病毒在2015年4月后进化处于缓慢保守状态。基于构建祖先结点序列的进化树主干分支氨基替换分析发现,YRD-E分支的病毒也缺乏抗原性相关的氨基酸突变。因此,通过对H7N9 HA基因的遗传变化、抗原性和种群适应度等相关分析发现2015年后YRD-E分支进化趋于缓慢和保守,进而推测LP H7N9可能在第5波中经历了短暂的“红皇后状态”（Red Queen Scenario）,并在大规模爆发后导致病毒种群迅速衰减。