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研究目的:在研究人的肿瘤、肝病、眼科病、骨骼病等疾病的过程中,发现血液中透明质酸(HA)的含量高于正常值。HA主要分布在细胞间质中,这些HA均以复合物的形式以共价键与软骨链蛋白(CLP)结合。一定浓度的盐酸胍可以使CLP与HA解离,目前没有人报道过猪软骨链蛋白(p-CLP)体内分布和代谢过程。为此,我们对以下内容进行初步探讨:①p-CLP的分离提取;②p-CLP与HA体外结合特征;③肺移植瘤裸鼠HA的瘤学分布;④p-CLP在肺移植瘤裸鼠中的组织分布。希望通过以上研究,获得p-CLP的生物学和实验核医学显像研究基础数据,为肺肿瘤成像和其它一些疾病的早期诊断提供实验依据。研究方法:1.肺腺癌动物模型与HA的瘤学分布A549肺腺癌细胞接种BALB/C-nunu荷瘤裸鼠,分别饲养3、4、5、6周,免疫组化SP法测定HA在不同周龄的肺移植瘤裸鼠中的瘤内分布。2. p-CLP的分离、纯化、鉴定利用亲和层析从猪肋软骨分离纯化p-CLP,通过环氧氯丙烷活化Sepharose4B、HA-AH-Sepharose4B亲和层析柱的制备,p-CLP粗制品匀浆、酶解、透析、浓缩、过柱、纯化制成p-CLP;然后SDS-PAGE凝胶电泳分析p-CLP的分子量;p-CLP氨基酸分析确定p-CLP中氨基酸的含量;体外放射竞争结合分析测定p-CLP与HA的亲和特性。3.p-CLP的碘标记及示踪分析Na125I氯胺-T氧化法标记p-CLP,摸索最佳反应条件,制备高比活度的放射性探针;示踪分布实验通过给肺移植瘤裸鼠尾静脉注射125I-p-CLP,分别在5min、20min、30min、45min、1h、1.5h、3h、5h、7h时间段处死裸鼠,取血及重要脏器测量放射性,获得p-CLP在裸鼠体内的代谢和分布参数。研究结果:1. HA免疫染色的阳性率为93%,免疫组化3-6周阳性组织光密度值分别为150.78±10.25、160.13±8.54、176.83±13.46、185.95±13.61,对照组为37.43±5.17。t检验显示各组有统计学意义(P<0.05)。免疫组化法发现接种3-6周裸鼠随着接种时间的延长,HA表达逐渐增强,HA主要分布于肿瘤细胞周边间质,肿瘤组织HA表达丰富,而正常组织表达微弱。2.亲和层析法提取p-CLP,紫外扫描为单一峰,抽提蛋白得率为2.21%,SDS-PAGE电泳显示p-CLP有两条条带,分别为(44.36±2.90)KD和(71.58±4.13)KD;p-CLP氨基酸分析显示谷氨酸含量最高(2.26mg/20mg),酪氨酸含量为0.91mg/20mg;体外放射竞争结合分析实验显示p-CLP与HA的亲和力常数Ka为(6.30±1.73)×109M-1。3.p-CLP标记显示当125I活度为0.925MBq、1.85MBq、3.7MBq、7.4MBq各组间标记率有显著性差异(均P<0. 05),7.4MBq、11.1MBq、14.8MBq组间标记率无差异(均P>0.05);当氯胺-T浓度为0.312mg/ml、0.625mg/ml时与其他各组间标记率有差异(均P<0. 05),其他各组间标记率无差异(均P>0.05);在30s-8min的标记时间中对标记率影响不大,各组均无差异(均P>0.05);125I活度、氯胺-T浓度、标记时间对放射化学纯度影响不大,各组无显著性差异(均P>0.05);氯胺-T浓度为0.625mg/ml和标记时间为1min时125I-p-CLP生物结合活性最高; p-CLP示踪分布实验表明,p-CLP浓度在体内20min时达到峰值,随着时间的延长,p-CLP在肿瘤内的分布百分比逐渐升高。结论:1.HA在肺肿瘤组织中有增高的趋势,其中在肿瘤细胞周边间质中有过多表达,随着肿瘤生长时间的延长,HA随肿瘤细胞的增长表达逐渐增强。2. p-CLP的最佳标记条件为:125I 7.4MBq、1.25mg/ml氯胺-T 30μl、p-CLP 0.5mg,反应体积100μl,反应1min。3.示踪实验显示,p-CLP在裸鼠体内早期呈全身分布,经肝脏代谢、部分由肾脏排泄,在裸鼠肺肿瘤模型中p-CLP能与肺肿瘤细胞间质中的HA特异结合。