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自1997年香港发生人感染H5N1亚型流感病毒事件以来,预防和控制H5N1亚型流感迫在眉睫。由于灭活疫苗和减毒疫苗等传统流感疫苗存在诸多问题,亟需研制预防H5N1亚型流感的新型疫苗。本文利用DNA、假型病毒和病毒样颗粒研究流感病毒H5亚型血凝素(hemagglutinin,HA)疫苗,主要开展了以下三个方面的工作:
1.用电转化法将编码H5-HA野生型基因(wtH5)的DNA疫苗pcDNA3.1/Zeo(+)-wtH5单独或与编码IL-2的重组质粒pcDNA3.1/Zeo(+)-IL-2共免疫小鼠,分别用ELISA和ELISPOT实验检测小鼠体液免疫反应和细胞免疫反应。结果显示,pcDNA3.1/Zeo(+)-wtH5单独或与pcDNA3.1/Zeo(+)-IL-2共免疫均能诱导小鼠产生特异性血清IgG,分泌大量IFN-γ,表明产生了特异性体液免疫反应和Th1型为主的细胞免疫反应。共免疫pcDNA3.1/Zeo(+)-IL-2显著增强了特异性血清IgG的产生,但对IFN-γ分泌的作用不显著,表明IL-2基因主要通过增强H5-HADNA疫苗诱导的体液免疫反应发挥免疫佐剂作用。
2.用基于MLV的假型逆病毒载体系统瞬时转染293T细胞,包装包膜含有H5-HA蛋白的假型病毒(pseudotypedvirusos,PTVs),并免疫小鼠,检测小鼠保护性免疫力或体液免疫反应。野生型H5-HA(wtH5)蛋白包装的wtH5N1PTVs展示剪切活化形式的HA蛋白,转导MDCK细胞不依赖TPCK胰酶。多碱性氨基酸剪切位点改造的突变型H5-HA(mtH5)蛋白包装的mtH5N1PTVs则展示未剪切活化形式的HA前体--HA0蛋白,转导MDCK细胞依赖TPCK胰酶。wtH5N1PTVs和mtH5N1PTVs皮下注射3次或者滴鼻2次、皮下注射1次免疫小鼠,可诱导小鼠产生针对异源H5N1亚型流感病毒的保护性免疫力。小鼠感染异源H5N1亚型流感病毒后,皮下注射免疫wtH5N1PTVs组体重丢失较少,获得不完全保护,而mtH5N1PTVs组小鼠体重不丢失,获得完全保护。在四途径免疫小鼠实验中,皮下注射免疫mtH5N1PTVs组产生的特异性血清IgG水平较wtH5N1PTVs组高,但血清中和抗体效价却较低。结果表明,皮下注射免疫mtH5N1PTVs与wtH5N1PTVs都能诱导小鼠的特异性体液免疫反应和保护性免疫力,mtH5N1PTVs诱导小鼠产生的血清中和抗体水平较低,但血清IgG水平较高,感染异源H5N1亚型流感病毒后体重不丢失,获得保护较好。
3.用表达Gag-Po1的包装质粒与表达Env的包装质粒瞬时转染293T细胞,包装包膜含有H5-HA蛋白的病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs),并免疫小鼠检测体液免疫反应和细胞免疫反应。野生型H5-HA(wtH5)蛋白包装的wtH5N1VLPs展示剪切活化形式的HA蛋白。多碱性氨基酸剪切位点改造的突变型H5-HA(mtH5)蛋白包装的mtH5N1VLPs则展示未剪切活化形式的HA前体-HA0蛋白。分别将wtH5N1vLPs和mtH5N1VLPs通过皮下注射、腹腔注射和肌肉注射免疫小鼠,可诱导特异性血清IgG、IgG1、IFN-γ和血清中和抗体,表明特异性体液免疫反应和Th1型为主细胞免疫反应的产生。与wtH5N1VLPs组相比较,皮下注射、腹腔注射和肌肉注射免疫mtH5N1VLPs组IFN-γ水平显著升高,在肌肉注射途径中尤为明显。肌肉注射免疫mtH5N1VLPs组还表现出特异性血清IgG较低,IL-4分泌水平较高,血清中和抗体效价较高。结果表明,mtH5N1VLPs与wtH5N1VLPs都能诱导特异性体液免疫反应和Th1型为主的细胞免疫反应,但mtH5N1VLPs诱导小鼠产生的细胞免疫反应更强,尤其是在肌肉注射途径中。