羊栖菜多糖的制备及对肠道屏障的保护作用研究

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羊栖菜(Sargassum fusiforme)是亚洲一些国家和地区常见的一种食用海藻,含有丰富的营养物质和矿物质元素,不仅具有较好的食用价值,也具备较高的药用价值,因此被誉为“长寿菜”,其主要的活性物质之一是多糖。本论文通过对羊栖菜多糖的提取、分离纯化、结构表征,以及对肠道屏障的保护作用进行研究,为羊栖菜多糖资源的开发利用提供理论依据。主要研究结果如下:(1)比较了不同提取方法(传统热水提取、纤维素酶辅助热水提取、超声辅助热水提取、脉冲电场辅助热水提取)所得羊栖菜多糖的理化性质和益生活性,发现纤维素酶辅助水提法制备的羊栖菜多糖得率最高(14.02%),其次分别为超声辅助水提多糖(12.57%)、脉冲电场辅助水提多糖(10.38%)、水提多糖(7.07%)。4种多糖的平均分子量在200-245 k Da之间,具有较高的耐热性,其溶液都是典型的非牛顿流体,并且表观粘度的大小与分子量呈现正相关。与空白组比较,4种多糖均能在一定程度上促进乳杆菌的增殖,其中纤维素酶辅助水提多糖的促增殖作用显著高于其它3种多糖(p<0.05)。由于纤维素酶辅助水提所得羊栖菜多糖得率最高、促进乳杆菌增殖活性最强,因此采用该法制备多糖用于后续研究。(2)采用纤维素酶辅助水提法得到羊栖菜多糖(SFP),其总糖含量、糖醛酸含量、蛋白含量和硫酸基含量分别为83.25%、12.80%、1.42%和7.81%,是一种典型的褐藻硫酸多糖。其单糖组成主要为岩藻糖(30.60%)、葡萄糖(29.86%)、鼠李糖(15.03%)、半乳糖(13.12%)、甘露糖(7.97%)和木糖(3.41%)。多糖表观形貌为片状和团状,表面光滑致密,在水溶液中糖链有聚集现象。通过体外肠道菌群酵解实验进一步探究SFP的益生活性。结果显示,与空白组相比,SFP组培养基中总碳水化合物含量和还原糖含量明显下降,说明微生物是可以利用SFP的,且利用率达到了53.17%。此外,SFP还能促进菌群产生短链脂肪酸(SCFA),增加乙酸、丙酸和正丁酸的生成,使培养基的p H值下降,低酸性的环境更加有利于维持肠道环境的稳定。通过16s RNA测序检测菌群组成变化,结果显示,SFP能够调节肠道菌群的组成,显著增加有益菌的丰度,比如Faecalibacterium、Ruminococcaceae_UCG-014、Bifidobacterium和Lactobacillus。(3)羊栖菜多糖(SFP)经过DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换树脂进行分离纯化,分别在洗脱溶剂(Na Cl)浓度为0.2 M、0.3 M、0.4 M和0.5 M处得到4个组分,命名为SFPⅠ、SFPⅡ、SFPⅢ和SFPⅣ,回收率分别为33.00%、5.68%、1.83%和2.66%。各组分的总糖含量在70%-82%之间,糖醛酸含量在8%-15%之间(含量随着洗脱剂浓度的增大而减少),硫酸基含量在2%-23%之间(含量随着洗脱剂浓度的增大而增大)。随着洗脱剂浓度的增大,4个组分的分子量整体出现增大的情况,分别为191.21 k Da(SFPⅠ)、179.61 k Da(SFPⅡ)、476.31 k Da(SFPⅢ)和466.18 k Da(SFPⅣ)。4个组分的单糖组成种类变化不大,但比例有所差异。紫外全波长扫描结果表明SFPⅠ和SFPⅡ基本不含杂质,而SFPⅢ和SFPⅣ在260 nm范围处有核酸的明显吸收峰。扫描电镜(SEM)和原子力显微镜(AFM)反映了它们的表观形貌,SFPⅠ呈现薄薄的不规则片状,在溶液中的分散性好且分子链无发生聚集和缠结现象;SFPⅡ则为较薄的块状和细长的分枝状,糖链聚集且粗糙度指数高;SFPⅢ和SFPⅣ在SEM观察下都显得非常致密厚实,糖分子也表现出聚集且彼此缠结为块、团状的现象。FTIR和NMR结果表明,SFPⅠ含有α型糖苷键和β型糖苷键,由多种不同单糖组成,属于杂多糖。(4)通过LPS刺激大鼠小肠上皮细胞IEC-6细胞24 h构建炎症模型,对羊栖菜多糖及其纯化组分在缓解炎症损伤、保护肠道屏障完整性的作用上进行了探究。结果表明SFP、SFPⅠ和SFPⅡ均能促进IEC-6细胞的划痕愈合,增加处于S期的细胞比例,促进细胞增殖;均能不同程度地抑制一氧化氮(NO)的分泌和白细胞介素(IL-6)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-1β)的表达。采用RT-qPCR技术在基因水平上研究羊栖菜多糖纯化组分SFPⅠ对LPS诱导的IEC-6细胞炎症损伤的保护作用。结果表明,SFPⅠ能显著下调IEC-6细胞中促炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β以及受体TLR4的m RNA表达,上调细胞紧密连接ZO-1、Occludin和粘蛋白MUC2的m RNA表达,实现对肠道屏障的保护。
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