论文部分内容阅读
目的：结直肠癌(CRC)是发病率较高的肿瘤之一,为提高治疗效果,寻找结CRC的早期诊断标志物或分子靶标显得尤为重要。长链非编码RNA(lncRNA)是非编码RNA中的一类,与许多疾病有关,尤其与肿瘤的发生发展有关。已有初步研究表明lncRNA GAPLINC与肿瘤发生发展有关。本研究将利用公共数据库的RNA序列(RNA-seq)数据资源,分析lncRNA在CRC组织中的表达特征及其在预后判断方面的潜在价值,并进一步研究GAPLINC在CRC发生发展过程的作用机制,探讨其潜在的临床应用价值。 方法：下载肿瘤基因图谱(TCGA)数据库中CRC相关的RNA-seq数据,进行lncRNA表达差异、功能、通路富集及调控网络分析,同时分析lncRNA差异表达对CRC患者预后的影响;利用lncRNA PCR芯片筛选3对CRC标本的癌组织和对应的癌旁组织差异表达的lncRNA;确定目标lncRNA GAPLINC后,对21对临床标本进行验证;培养CRC株(HCT116),构建GAPLINC表达质粒和合成siRNA转染HCT116细胞,研究其对HCT116细胞迁移、侵袭及凋亡的影响;核质分离实验确定GAPLINC在细胞质和细胞核的表达情况,生物信息学方法预测与GAPLINC结合的miRNA,RNA pull-down及荧光素酶报告基因实验确定目标miRNA,并对21对临床标本验证其相关性,同时构建目标miRNA mimics转染HCT116细胞,观察其对肿瘤细胞迁移、侵袭能力及细胞凋亡的影响;通过生物信息学方法预测目标miRNA调控靶基因,RT-qPCR和WB检测抑制GAPLINC和增加miR-34a的表达对靶基因表达的影响;同时通过RT-qPCR检测21对临床标本的靶基因与目标miRNA和GAPLINC表达的相关性。 结果：对TCGA数据进行分析,结果提示有119个lncRNA存在差异性表达,lncRNA和编码基因(coding gene)存在共表达关系,对基因富集性分析发现,lncRNA参与细胞的多个生物学行为,lncRNA-miRNA-mRNA存在密切的调控网络,其中16个lncRNA对患者生存预后显著相关。LncRNA PCR芯片结果表明,CRC组织中存在较多的lncRNA表达异常,其中GAPLINC在CRC中表达表达量显著高于正常对照组织;21对临床标本也证实CAPLINC在肿瘤组织的表达量显著高于癌旁正常组织;培养HCT116细胞,GAPLINC的过度表达可增加HCT116细胞的迁移和侵袭能力,同时抑制细胞凋亡,抑制GAPLINC的表达则出现相反的现象;核质分离实验表明GAPLINC主要表达于细胞质后,根据生物信息学方法预测10个可能与GAPLINC结合且与CRC发病相关的miRNA,RNA pull-down和荧光素酶报告基因实验证实miR-34a为目标miRNA;21对临床样本RT-qRCR亦证实GAPLINC与miR-34a的表达显著负相关;将miR-34mimics转染HCT116细胞或与GAPLINC表达质粒共同转染HCT116细胞,结果表明miR-34a mimics可降低肿瘤细胞的迁移及侵袭能力,抵消部分GAPLINC的作用;预测miR-34a靶基因,确定c-MET为miR-3a调控的靶基因,HCT116细胞转染GAPLINC siRNA和miR-34a mimics后均可使c-MET的表达量降低;临床标本证实miR-34a与c-MET的表达显著负相关,同时GAPLINC与c-MET的表达呈显著正相关。 结论：生物信息学分析显示lncRNA在CRC发生发展过程中起着重要作用,参与多个生物学行为,对CRC患者预后判断及实验设计具有一定指导意义;其中GAPLINC其具有促进CRC细胞的迁移、侵袭,同时抑制细胞凋亡的作用,从而发挥其致癌作用;其主要作用机制为通过竞争性结合miR-34a,进而影响c-MET的表达,实现对肿瘤发生发展的调控,在CRC诊断及靶向治疗等方面具有潜在的临床意义。