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研究目的:观察热炎宁合剂(RYN)联合利奈唑胺(LNZ)对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)及其耐药生物被膜(BF)的影响,并探索其协同抑菌机制。研究方法:采用微量稀释法测定LNZ、RYN对MRSA的最小抑菌浓度(MIC);棋盘法测定两药联用对MRSA的分数抑制浓度指数,确定最小抑菌浓度比;微孔板法测定给药对MRSA BF形成前后活菌数的变化;激光共聚焦显微镜(CLSM)观察LNZ、RYN各自单用及联用对MRSA BF内活死菌数量的影响;扫描电镜(SEM)观察LNZ、RYN各自单用及联用MRSA BF的形态学变化;生物膜渗透实验观察LNZ、RYN各自单用及联用对MRSA BF渗透性的影响;通过RT-PCR检测RYN、LNZ各自单用及联用对MRSA BF相关基因sar A、agr A、agr B、agr C、agr D、atl A、RNAIII表达的影响;通过超高压液相色谱-飞行时间质谱仪法(UPLC-TOF-MS)分析RYN、LNZ各自单用及联用干预MRSA成熟期BF菌体的内源性代谢物谱特征。研究结果:LNZ和RYN对MRSA的MIC分别为4μg/ml和1/2RYN原液;最小抑菌浓度比为2μg/ml LNZ+1/32RYN,FICI值=0.625,表现为相加作用。对于BF形成前的MRSA,2μg/m l LNZ单独对活菌的抑制作用优于1/16RYN组,2μg/ml LNZ+1/16RYN抑菌作用优于单独2μg/ml LNZ或1/16RYN组。对于BF形成后的MRSA,2μg/ml LNZ单独对膜内活菌无抑制,RYN(1/8RYN、1/16RYN、1/32RYN)单独或联合2μg/ml LNZ对膜内活菌均抑制,2μg/ml LNZ+1/16RYN为最佳抑菌浓度比,其联用抑菌效果优于单独2μg/ml LNZ或1/16RYN组。对于BF形成后的MRSA,2μg/ml LNZ组与空白(Control)组的活、死菌荧光信号强度无差异;1/16RYN组的活菌荧光信号强度均小于2μg/ml LNZ组与Control组,死菌荧光信号强度均大于二者;2μg/ml LNZ+1/16RYN组活、死菌荧光强度均低于空白组、2μg/ml LNZ组、1/16RYN组。2μg/ml LNZ作用MRSA BF菌体形态与空白组无差异,1/16RYN组MRSA无膜结构包被,菌体间排列松散,2μg/ml LNZ+1/16RYN组MRSA无膜结构包被,菌体间排列松散,大小不一。对于BF形成后的MRSA,与Control组相比,药物干预组的7个BF相关基因sar A、agr A、agr B、agr C、agr D、atl A、RNAIII的表达受到抑制,具体是2μg/ml LNZ组、2μg/ml LNZ+1/16RYN组对其均有抑制,而1/16RYN组除agr C外均有抑制;1/16RYN组与2μg/ml LNZ组相比,1/16RYN组agr D的抑制效应高于2μg/ml LNZ组;各自单用与联用组相比,2μg/ml LNZ+1/16RYN组中agr C、agr D、sar A、atl A的抑制效应高于2μg/ml LNZ组,agr C、sar A、atl A的抑制效应高于1/16RYN组。代谢组学分析发现:1,3,7-trimethyluric acid、2-methylbutanoyl-coenzyme A、3-dehydrocarnitine等27个代谢物是BF形成前后的差异代谢物,反映了BF形成的代谢物谱特征;2-methylacetoacetyl-coenzyme A、2-succinylbenzoyl-coenzyme A、3-dehydrocarnitine等28个代谢物是2μg/ml LNZ干预MRSA BF前后的差异代谢物,反映了2μg/ml LNZ干预MRSA BF的药效的代谢物谱特征;3-dehydrocarnitine、ADP-D-ribose、bis(3’,5’)-cyclic diguanylic acid等25个代谢物是1/16RYN干预MRSA BF前后的差异代谢物,反映了1/16RYN干预MRSA BF的药效的代谢物谱特征;1-O-caffeoylglucose、3-(methylthio)propionic acid、3-dehydrocarnitine等21个代谢物是1/32 RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF前后的差异代谢物,反映了1/32 RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF的药效的代谢物谱特征;1-O-caffeoylglucose、2-methylbutanoyl-coenzyme A、3-dehydrocarnitine等32个代谢物是1/16 RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF前后的差异代谢物,反映了1/16RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF的药效的代谢物谱特征;1-O-caffeoylglucose、2-methylacetoacetyl-coenzyme A、3-(methylthio)propionic acid等30个代谢物是1/8RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF前后的差异代谢物,反映了1/8 RYN+2μg/m L LNZ干预MRSA BF的药效的代谢物谱特征;通过RYN和LNZ各自单用和联用的差异代谢物比较,发现3-dehydrocarnitin、ADP-D-ribose、homocitrulline等10个代谢物是共同的差异代谢物,其中3-dehydrocarnitine、homocitrulline、kynurenine、L-leucine、L-tyrosine是联用的代谢标志物。通过不同RYN给药剂量组差异代谢物的比较,发现1-O-caffeoylglucose、3-dehydrocarnitine、glycerol等12个代谢物是共同的差异代谢物,其中homocitrulline、sn-glycerol-3-phosphate、tyrosine methyl ester是有剂量依赖的代谢标志物。研究结论:1.RYN可提高MRSA对LNZ的敏感性,降低LNZ的MIC,对MRSA BF具有破坏抑制作用,降低MRSA因BF而产生的耐药保护,帮助LNZ突破BF而接触到深层代谢缓慢的休眠细菌,促进抗生素对MRSA的清除。2.通过增强对sar A和atl A的抑制,LNZ联合RYN发挥抑制BF生成、限制MRSA黏附,并通过降低细菌自溶作用以减少胞外DNA的释放,以此达到协同抑菌作用。3.3-dehydrocarnitine、homocitrulline、kynurenine、L-leucine、L-tyrosine是LNZ联合RYN发挥抑制BF、协同抑制MRSA作用的代谢标志物,homocitrulline、sn-glycerol-3-phosphate、tyrosine methyl ester是反映RYN在联用时的药效代谢标志物,这些标志物具有剂量依赖关系。4.本研究为临床上RYN联合LNZ治疗MRSA提供理论依据,同时也为开辟中药联合抗生素对抗难治性耐药菌感染的治疗方案奠定基础。