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胱抑素C（Cystatin C，CysC）即半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，是一种非糖基化的碱性低分子量蛋白质。该蛋白能够在所有有核细胞中稳定表达，几乎不受年龄、性别、体重、感染、饮食、体表面积等因素的影响。胱抑素C是迄今为止基本能够满足肾小球滤过率（GFR）理想内源性标志物要求的物质，对于早期肾功能损伤的诊断和治疗具有重要意义。其检测方法主要是免疫学法，但目前国内CysC诊断试剂及标准品主要由国外公司提供，价格昂贵，使病人和社会医疗成本较高。因此，胱抑素C免疫诊断试剂盒的自主研发具有重要的价值和意义。目的：获得Trx-CysC以及无蛋白标签的CysC两种可溶性重组蛋白。用纯化的无蛋白标签CysC重组蛋白制备蛋白标准品。用Trx-CysC作为免疫原免疫新西兰大白兔获得CysC的多克隆抗体，建立CysC颗粒增强透射免疫比浊法（particle enhanced turbidimetric immunoassay，PETIA）并进行初步方法学评价，为该方法的临床应用奠定基础。方法：1.在不改变氨基酸序列的前提下，对CysC的全长编码基因进行大肠杆菌同义密码子偏好性优化后人工合成其序列，并插入原核表达载体pET32（a+），构建CysC优化后的原核表达质粒pET32（a+）-CysC。经测序鉴定正确后，将该重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导重组蛋白可溶性表达并纯化获得Trx-CysC。2.从HL60细胞株提取总RNA，行RT-PCR获得cDNA模板，再经高保真PCR获得CysC的DNA片段。将该人CysC的全长编码基因插入原核表达载体pCold TF,构建CysC原核表达质粒pCold TF-CysC。待测序结果与预期相符后，将该重组质粒pCold TF-CysC转化到大肠杆菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导重组蛋白表达并纯化获得可溶性重组蛋白TF-CysC。利用GST-HRV3C蛋白酶切除该融合蛋白的TF标签，再经分子筛去除TF标签、3C蛋白酶获得无蛋白标签的CysC，SDS-PAGE鉴定其纯度。3.用纯化的重组蛋白Trx-CysC作为免疫原免疫新西兰大白兔，经蛋白A柱纯化制备CysC多克隆抗体。4.采用已纯化的CysC多克隆抗体包被胶乳颗粒，建立检测CysC的PETIA方法，并进行初步方法学评价。结果：1.经分子克隆和蛋白表达技术，获得了可溶性表达的Trx-CysC。由于该重组蛋白带有6×His标签，所以可通过镍柱亲和纯化获得高纯度的重组蛋白制品。以该蛋白免疫新西兰大白兔，获得CysC的多克隆抗体。2.经分子克隆和蛋白表达技术，获得了可溶性表达的TF-CysC,并通过镍柱和分子筛两步纯化法成功获得无蛋白标签、可作为蛋白标准品的CysC。3.用自制的CysC多克隆抗体包被胶乳颗粒，建立检测CysC的PETIA方法，该方法与进口商品化试剂盒具有良好的相关性，具有一定的应用潜力和市场前景。结论：1.利用分子克隆和重组蛋白技术获得了可溶性的重组蛋白Trx-CysC，利用此该蛋白作为免疫原制备获得了兔抗人CysC多克隆抗体。2.利用分子克隆、原核表达和蛋白纯化技术获得了可溶性的无蛋白标签的CysC。该CysC蛋白可作为CysC体外免疫诊断盒的蛋白标准品。3.采用自制的CysC多克隆抗体建立了检测CysC的PETIA。该方法与商品化进口试剂盒有较好的可比性，符合临床应用要求。