研究背景牙髓炎和根尖周炎是目前口腔临床上最常见的疾病,而牙髓由于其自身的特点,一旦受损就很难恢复,所以针对这些患牙进行的根管治疗,就是要移除根管内残留的所有的牙髓组织,并用人工充填材料如牙胶等代替所移除的牙髓组织严密充填根管。虽然随着材料和技术的发展,根管治疗能获得较高的成功率,但是由于失去了牙髓,牙齿在缺乏血管滋养且失去神经系统及免疫系统的保护的情况下,牙齿的脆性增强,从而导致患牙的抗性下降,容易出现牙折和根裂等情况。因此,对于感染牙髓的理想治疗方法应该要包含牙髓再生,即再生性牙髓治疗,通过体外诱导干细胞成牙分化后形成三维组织结构,整合入血管、神经等,移植到根管内并为其提供血运重建和神经再生的诱导微环境,从而保证移植组织生存并形成牙髓组织,发挥牙髓该有的功能。研究目的本研究将构建SDF-1和/或VEGF过表达慢病毒并分别转染进入内皮祖细胞中,旨在构建能稳定过表达SDF-1和/或VEGF的内皮祖细胞,突破体外局部滴加药物的局限性,更利于内皮祖细胞血管生成方面的体内临床研究。同时对3D细胞培养的细胞接种密度及接种时间进行分析,旨在建立一种适用于牙髓干细胞研究的较优化的3D细胞培养条件,并观察3D细胞培养的细胞生物学特性,旨在为牙髓再生培养出更优化的组织团块。本研究通过将转染后的内皮祖细胞和人牙髓干细胞进行3D共培养,比较不同的培养组合下人牙髓干细胞的成牙/成骨特性和内皮祖细胞的血管形成特性,旨在寻求用于进一步牙髓再生研究的最佳细胞组合。本研究亦通过采用牙髓干细胞和内皮祖细胞的最佳组合在CAM模型上观察血管在3D细胞团块中的生长情况和速度,为将来在牙髓再生的临床研究中进行细胞团块的种植提供参考。研究内容第一部分人牙髓干细胞和内皮祖细胞的分离、培养和鉴定实验一人牙髓干细胞的分离、培养、鉴定一、方法1、人牙髓干细胞的分离及培养：采用组织块预消化培养法从成年人健康阻生第三磨牙或因正畸拔除的双尖牙牙髓组织中分离得到人牙髓干细胞,并进行培养。2、人牙髓干细胞的鉴定：从以下3个方面对人牙髓干细胞进行鉴定,①从培养细胞形态学方面进行观察；②通过流式细胞检测分析来源于间充质组织的干细胞表面标记物(CD44. CD71和CD90)；③分化能力鉴定,对培养的细胞分别进行成牙本质/成骨、成脂及成软骨方向诱导,对诱导21d的细胞分别进行茜素红、尼罗红及阿利新兰染色。二、结果1、人牙髓干细胞的生长和形态：分离得到的细胞呈长梭形成纤维样细胞形态,待长满瓶底80%后传代,平均3-5d传代一次,随着生长密度增加,细胞呈现放射状或涡旋状排列。2、细胞表面标记物检测：流式细胞分析结果显示CD44、CD71和CD90呈(+)表达,表达率分别为99.58%,99.51%和99.79%。3、多向分化能力：细胞经成牙本质/成骨诱导后,茜素红染色示大小不等的红褐色矿化结节；经成脂诱导后,尼罗红染色示荧光镜下见细胞内红染,经成软骨诱导后,阿利新兰染色可见大量蓝染区域。实验二内皮祖细胞的分离、培养、鉴定一、方法1、内皮祖细胞的分离及培养：采用密度梯度离心法从新鲜健康的脐带血中分离得到内皮祖细胞,并进行培养。2、内皮祖细胞的鉴定：从以下3个方面对内皮祖细胞进行鉴定,①从培养细胞形态学方面进行观察；②通过流式细胞检测细胞周期；③通过流式细胞检测分析细胞表面标记物(内皮细胞表面标记物CD3、KDR和CD105,造血细胞表面标记物CD45和CD14,干细胞表面标记物CD34和CD133)。二、结果1、内皮祖细胞的生长和形态：细胞原代培养第5d呈长梭状,2w后呈克隆生长,平均2-3d传代一次,随着生长密度增加,细胞呈现铺路石状排列。2、细胞周期：流式细胞仪细胞周期分析结果显示,所培养细胞各细胞周期比率G1、G2及S期比率分别为75.08%、9.15%及15.77%,S/G/M细胞比率较高,细胞周期显示为慢周期性,符合干细胞的特性。3、细胞表面标记物检测：流式细胞分析结果显示CD3、CD105和KDRCD105呈(+)表达,表达率分别为99.82%、98.91%和92.11%；CD45、CD34、 CD133和CD14呈(一)表达,表达率分别为0.06%、7.51%、0%和1.1%。第二部分内皮祖细胞稳定过表达VEGF和/或SDF-1一、方法1、获取含有目的基因(VEGF/SDF-1)的过表达慢病毒：制备VEGF/SDF-1过表达慢病毒载体,进行VEGF/SDF-1过表达慢病毒包装,并对其滴度进行检测。2、过表达慢病毒的鉴定：将VEGF/SDF-1过表达慢病毒转染进入293T细胞中,荧光显微镜观察细胞荧光情况或进行Puromycin药物筛选,收集细胞提取蛋白后Werstem Blot检测VEGF/SDF-1表达情况。3、病毒预感染实验：确认EPCs分别感染两种慢病毒的感染条件和感染参数。4、内皮祖细胞的稳定转染及转染后细胞的血管生成特性分析：将VEGF/SDF-1过表达阳性/阴性慢病毒稳定转染进入内皮祖细胞后,荧光显微镜观察细胞荧光情况或进行Puromycin药物筛选,运用qRT-PCR检测mRNA水平上VEGF/SDF-1表达情况,Werstern Blot检测蛋白水平上VEGF/SDF-1表达情况。Tube Formation Assay检测转染后细胞成管能力。二、结果1、获取了VEGF/SDF-1过表达慢病毒,并对阳性克隆测序进行比对,与基因库中序列一致。VEGF/SDF-1过表达慢病毒的滴度均为2E+9TU/ml。2、转染VEGF过表达慢病毒后的293T细胞,荧光显微镜观察可见超过90%的细胞有绿色荧光,荧光强度适中。转染SDF-1过表达慢病毒后的293T细胞,进行Puromycin药物筛选后仍有大量细胞存活,且细胞增殖能力强。两种细胞的Werstern Bolt结果显示均可见VEGF/SDF-1蛋白条带。3、病毒预感染实验：对内皮祖细胞进行Puromycin药物筛选的浓度为0.4μg/ml。对于VEGF过表达慢病毒,内皮祖细胞在ENi.S+5μg/ml polybrene条件下容易感染,达到80%感染时所需要的MOI值为5；对于SDF-1过表达慢病毒,内皮祖细胞在Complete Medium条件下容易感染,达到80%感染时所需要的MOI值为5。4、转染VEGF过表达慢病毒后的内皮祖细胞,荧光显微镜观察可见超过80%的细胞有绿色荧光,荧光强度适中。转染SDF-1过表达慢病毒后的内皮祖细胞,进行Puromycin药物筛选后仍有大量细胞存活,且细胞增殖能力强。对转染SDF-1过表达慢病毒的内皮祖细胞再次转染VEGF过表达慢病毒,荧光显微镜观察可见超过80%的细胞有绿色荧光,荧光强度适中。qRT-PCR结果显示,感染VEGF过表达慢病毒的细胞VEGF表达量较阴性对照细胞增加约2倍,感染两种过表达慢病毒的细胞VEGF表达量较阴性对照细胞增加约3倍；感染VEGF过表达慢病毒的细胞SDF-1表达量较阴性对照细胞增加约15倍,感染两种过表达慢病毒的细胞SDF-1表达量较阴性对照细胞增加约17倍。Werstern Blot结果显示均可见VEGF/SDF-1蛋白条带。Tube Formation Assay显示,24h后均可见单层细胞相连成小管结构,其中EPCs(VEGF+SDF-1+)和EPCs(VEGF+)细胞形成的小管较阴性细胞管腔密度更大,分支更多,管腔直径更小。第三部分3D细胞培养人牙髓干细胞的特性研究实验一细胞浓度和培养时间对3D培养人牙髓干细胞的影响一、方法1、人牙髓干细胞的3D培养：取第2-5代的人牙髓干细胞,根据接种细胞数分为三组(2.5×104cell/孔、1×105cell/孔和2.5×105cell/孔),将三组细胞分别接种至3D培养板中,每天换液,于第2、3、4和5天收集3D细胞聚合物。2、对3D人牙髓干细胞细胞聚合物的分析：从以下3个方面对3D人牙髓干细胞细胞聚合物进行分析,①测量3D细胞聚合物的直径；②对第3天的3D细胞聚合物进行HE染色观察内部结构；③使用PI/Calcein-AM荧光染料检测3D细胞聚合物中细胞的活性。二、结果1、3D-DPSCs细胞聚合物直径：第一组(2.5×104cell/孔)第2-5d的细胞聚合物直径分别为0.51mm,0.53mm,0.49mm和0.51mm；第二组(1×105cell/孔)第2-5d的细胞聚合物直径分别为0.99mm,0.86mm,0.77mm和0.72mmm；第三组(2.5×105cell/孔)第2-5d的细胞聚合物直径分别为1.54mm,1.19mm,1.22mm和1.13mm。2、HE染色：三组3D-DPSCs细胞聚合物细胞排列紧密,其中第三组(2.5×105cell/孔)细胞聚合物中心区可见出现液化坏死现象,另外两组均未观察到显著的液化坏死现象。3、3D-DPSCs细胞聚合物的细胞活性：随着细胞接种密度增加,所形成的3D-DPSCs细胞聚合物中死细胞(表现为红色荧光的细胞)比例逐渐增高,第三组可以观察到中心区域有显著的死细胞集中。实验二3D人牙髓干细胞细胞聚合物的生物特性一、方法1、流式细胞检测细胞相对大小：对同一批细胞进行2D和3D培养,收集第3天的培养物,流式细胞分析其细胞相对大小。223D-DPSCs细胞聚合物的成牙本质/成骨能力：对同一批细胞进行2D和3D培养,收集第3天的培养物,对其进行成牙本质/成骨方向诱导,诱导21d后进行茜素红染色,运用qRT-PCR检测mRNA水平上ALP、DSPP、OPN和DMP-1表达情况。3、3D-DPSCs细胞聚合物的抗炎特性：对同一批细胞进行2D和3D培养,收集第3天的培养物,运用qRT-PCR检测mRNA水平上TSG-6、IL8和STC-1表达情况；收集培养上清后,运用ELISA检测上清中TSG-6的含量。二、结果1、流式细胞检测细胞相对大小：3D培养的细胞的体积约是2D培养的的一半。2、3D-DPSCs细胞聚合物的成牙本质/成骨能力：经成牙本质/成骨诱导后,茜素红染色示2D培养的细胞可见大小不等的红褐色矿化结节,而3D培养的细胞聚合物可见整体红褐色；qRT-PCR示ALP、DSPP、OPN和DMP-1表达在3D-DPSCs细胞聚合物中较2D-DPSCs细胞中分别增加约4、4、2和3倍。3、3D-DPSCs细胞聚合物的抗炎特性：mRNA水平上TSG-6、IL8、STC-1和TNFa表达在3D-DPSCs细胞聚合物中较2D-DPSCs细胞中分别增加约90、29、13和1.5倍；ELISA示TSG-6在3D-DPSCs细胞聚合物中的含量为67.28pg/ml,在2D-DPSCs细胞中的含量为30.88pg/ml。第四部分3D-DPSCs/EPCs共培养物成牙本质/成骨特性和促血管生成特性的研究实验一3D-DPSCs/EPCs共培养物成牙本质/成骨特性的鉴定一、方法1、3D-DPSCs/EPCs共培养：取第2-5代的人牙髓干细胞与第5-10代的内皮祖细胞按照细胞数1：1的比例,以1×105cell/孔的接种细胞密度接种至3D培养板中,共分为6组：3D-DPSCs/EPCs(VEGF+)；3D-DPSCs/EPCs(SDF-1+)、3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)、3D-DPSCs/EPCs (VEGF-SDF-1-)、3D-DPSCs/EPCs和3D-DPSCs,每天换液,于第3天收集3D细胞共培养物。2、3D-DPSCs/EPCs共培养物成牙本质/成骨特性：对其进行成牙本质/成骨方向诱导,诱导21d后从以下3个方面进行鉴定,①茜素红染色：②运用qRT-PCR检测mRNA水平上ALP、DSPP、OPN和DMP-1表达情况；③采用细胞免疫荧光检测DMP-1蛋白表达情况。二、结果1、茜素红染色：6组共培养物均可见整体呈红褐色,组间未见显著差异,均较未诱导组颜色深。2、qRT-PCR:在mRNA水平上六组细胞聚合物中ALP.DSPP.OPN和DMP-1的表达量均存在显著差异,其中3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)细胞聚合物中ALP.DSPP.OPN和DMP-1的表达量均最高。3、细胞免疫荧光：6组细胞在胞浆部位均可见明显的DMP-1表达,其中3D-DPSCs/EPCs(VEGF+)组和3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)组的表达较强一些。实验二3D-DPSCs/EPCs共培养物促血管生成特性的鉴定一、方法1、人牙髓干细胞/内皮祖细胞3D的共培养：取第2-5代的人牙髓干细胞与第5-10代的内皮祖细胞按照细胞数1：1的比例,以1×105cell/孔的接种细胞密度接种至3D培养板中,共分为6组：3D-DPSCs/EPCs(VEGF+)、3D-DPSCs/EPCs(SDF-1+)、3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)、3D-DPSCs/EPCs (VEGF-SDF-1-)、3D-DPSCs/EPCs和3D-EPCs,每天换液,于第3天收集3D细胞共培养物。2.3D-DPSCs/EPCs共培养物血管生成特性：从以下3个方面进行鉴定,①Tube Formation Assay检测转染后细胞成管能力；②运用qRT-PCR检测mRNA水平上CD34、Flk、CD117和vWF表达情况；③采用Werstern Blot检测蛋白水平上vWF表达情况。二、结果1.Tube Formation Assay:加入6组细胞24h后,3D.EPCs和3D-DPSCs/EPCs小管结构基本消失；继续培养24h后3D-DPSCs/EPCs(VEGF+)、3D-DPSCs/EPCs(SDF-1+)和3D-DPSCs/EPCs(VEGF-SDF-1-)小管结构基本消失；仍保持有小管结构的是3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)组。2、qRT-PCR:结果显示,在mRNA水平上六组细胞聚合物中CD34.Flk.CD117和vWF的表达量均存在显著差异,其中3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)细胞聚合物中CD34、Flk、CD117和vWF的表达量均最高。3.Werstern Blot:与3D-EPCs中相应蛋白的表达水平进行比较发现,vWF表达在3D-DPSCs/EPCs(VEGF+)中增高约1.71倍,在3D-DPSCs/EPCs(SDF-1+)中增高约1.46倍,在3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)中增高约2.07倍。第五部分3D-DPSCs/EPCs共培养物在CAM模型血管生成研究一、方法1、3D-DPSCs/EPCs共培养：取第2-5代的人牙髓干细胞与第5-10代的内皮祖细胞(VEGF+SDF-1+)按照细胞数1：1的比例,以1×105cell/孔的接种细胞密度接种至3D培养板中,每天换液,于第3天收集3D细胞共培养物。2、鸡胚尿囊绒毛膜血管形成实验：取7日龄的受精鸡胚,制备鸡胚绒毛尿囊膜血管生成模型,将3D细胞共培养物种植到绒毛膜上,于第6、7、8、9和10天进行拍照并收集3D细胞共培养物。从以下2个方面对使用大体观察结合HE染色进行分析,①聚合物周围血管生长情况；②聚合物内部血管生成情况。二、结果1、确认接种成功：3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)细胞聚合物在CAM模型上培养5天后显微镜下可见两个白色较致密团块,大小不等,荧光下观察可见两个团块均有绿色荧光表达,荧光强度适中。2、聚合物周围血管生长情况：培养6天后,3D细胞聚合物附近及周边区域未见明显血管生成；培养7天后,3D细胞聚合物附近及周边区域血管生成增多；随着培养时间增加,3D细胞聚合物附近及周边区域血管生成增多情况越明显,尤其在3D细胞聚合物附近区域血管生成增多的情况更明显。3、聚合物内部血管生成情况：培养第7天后,3D细胞聚合物内部中心区域未观察到液化坏死现象,与绒毛膜接触部位有新生血管。第10天新生血管基本布满整个聚合物,结合动态观察结果,长入聚合物中的血管可观察到明显的血液流动,由鸡胚尿囊绒毛膜的血管往聚合物中流入。结论1、采用组织块预消化培养法从牙髓组织中分离得到细胞呈长梭形、成纤维样细胞形态,增殖速度较快,是一种来源于间充质干细胞,具有多向分化的干细胞特性,可以认为是DPSCs。采用密度梯度离心法从脐带血分离培养的细胞是一类具有良好增殖能力的,细胞周期为慢周期性,且可分化成为成熟的内皮细胞的EPCs。两种细胞均能为后续实验提供良好的体外细胞模型,运用于牙髓再生或血管再生研究中。2、成功构建了含有VEGF/SDF-1过表达基因的慢病毒载体,并且有效的感染进入EPCs中,能稳定过表达有效的VEGF和SDF-1,促进血管生成,能为后续实验提供良好的生长因子添加模型,运用于体内实验甚至将来的临床实验的血管再生研究中。3、采用悬滴法使用1x105cell/L的细胞接种密度接种DPSCs进行3D培养,培养3d后采集的3D-DPSCs细胞聚合物,细胞活性和聚合物直径达到最佳平衡状态,其细胞体积变小,成牙本质向分化能力增强,同时具有一定的抗炎特性,这些生物性能的优化更有利于运用在牙髓再生领域,治疗感染牙髓。4、成功构建了DPSCs和EPCs的3D共培养模型；EPCs及VEGF和SDF-1的联合运用对3D-DPSCs的成牙本质分化能力具有促进作用；VEGF和SDF-1的联合运用对3D-DPSCs/EPCs的血管生成作用具有协同促进作用；在成牙本质分化和血管生成能力方面而言,3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)是最优组合,可用于进一步的牙髓再生的体内研究。5、在CAM以模型上,3D-DPSCs/EPCs(VEGF+SDF-1+)聚合物能促进周围血管生长,同时能有效的促进内部血管生成,为进一步的动物实验提供理论支持和数据参考。