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松材线虫[Bursaphelenchus xylophilus（Steiner&Buhrer,1934）Nikle，1970]引起的松树萎蔫病对日本、韩国、葡萄牙和中国（局部地区）的松树造成危害。自1982年松材线虫传入我国局部地区以来，已给我国林业生产和对外贸易造成严重危害。温度直接影响着松材线虫的生长发育及松材线虫病的发生发展。在日本松材线虫在年平均气温高于14℃地区普遍发生，在年平均气温10～12℃的地区能够侵入，一般不造成危害。另外，夏季高温和生长季节的干旱有利于病害的发展，平均温度高于25℃的天数持续55d以上与病害严重发生有极密切的相关性。我国目前松材线虫病发生地区的年平均气温都在14℃以上。高温不利于松材线虫的存活，但松材线虫能在年均温较高的地区存活并引起松树萎蔫病。高温环境下，松材线虫体内是否存在特异表达的基因、这些基因是否有助于松材线虫度过高温环境、松材线虫体内存在哪些应激基因可以抵抗高温的不利影响、这些基因的功能如何等问题迫切需要解决。 热激蛋白90家族(heat shock protein90 families，HSP90s)是一种生物普遍存在、高度保守、细胞生存必需的分子伴侣（molecular chaperon）蛋白，在正常生理条件下表达量占胞质蛋白的1-2％，在应激状态下产生诱导性高表达，故又称热应激蛋白90(heat stress protein90)。 通过抑制消减杂交和反向Northern鉴定的方法首次分离到松材线虫热激蛋白90基因(HSP90)，并应用SL法克隆到全长mRNA共计1206bp。已在NCBI注册:EF490991。对该基因进行Blastx比对结果表明该序列翻译为蛋白质序列后与大豆胞囊线虫（Heterodera glycines）的Hsp90蛋白序列(NCBI: AAO14563)相近。内含子分析表明基因组序列中2个内含子将整个基因组序列分割为3个外显子。 根据RT-PCR电泳结果分析可知松材线虫生长繁殖最适温度25℃培养条件下HSP90基因表达为20％;松材线虫不能发育温度4℃条件下培养HSP90基因表达为10％;松材线虫增殖受抑制温度30℃时HSP90基因表达量明显增高，为100％;松材线虫不能繁殖温度35℃基因表达为50％;40℃热激15min后HSP90基因表达量也有明显增高，为80％。 应用原位杂交的方法，HSP90基因定位于线虫食道后部和肠前部，在不同温度下基因表达量与RT-PCR结果相同。正义RNA探针对照杂交结果为阴性，未检测到信号;25℃培养条件下反义RNA探针杂交结果为阳性，但信号较弱，表明表达量较少;30℃培养条件下反义RNA探针杂交结果为阳性，信号强，表明表达量较高;40℃热激15min培养条件下反义RNA探针杂交结果为阳性，信号较强。 对该基因序列进行可读框架分析（Open Reading Frame Finder，ORF Finder）发现可以编码362个氨基酸。应用pQE-30 UA载体进行原核表达，采用Ni-NTA Superflow纯化6×His-tagged融合蛋白后SDS-PAGE电泳表明该基因编码蛋白质为90Kda，应用SWISS-MODEL在线对该基因编码的蛋白质进行了三维建模，通过同源三维结构比对，进一步修正三维结构。 用PSORT(Prediction of Protein Localization Sites) version6.4对HSP90进行亚细胞定位，发现该蛋白主要定位于质膜、内质网膜、线粒体内膜和内质网管腔上。进一步应用TMHMM3.0 Server对该蛋白进行跨膜结构域的预测，未发现膜蛋白跨膜区域信息，显示该蛋白没有跨膜区段。 分别测定了不同培养温度下正常培养、HSP90基因沉默和HSP90基因过量表达时松材线虫的存活率: 4℃培养条件下正常培养的松材线虫存活率接近100％，HSP90基因过量表达培养条件下松材线虫存活率接近80％，只有HSP90基因被抑制的RNAi试验中到试验结束时松材线虫的存活率仅为10％。 25℃培养条件下，正常培养的松材线虫存活率由100％(1d-3d)逐渐下降到70％(12d)。HSP90基因过量表达培养条件下松材线虫存活率较平稳，一直高于80％。HSP90基因被抑制的RNAi试验中松材线虫的存活率下降较快，到试验结束时为10％。 30℃培养条件下，正常培养的松材线虫存活率由100％(1h-28h)逐渐下降到0％(10d)。HSP90基因过量表达培养条件下松材线虫存活率较平稳，一直高于60％。HSP90基因被抑制的RNAi试验中松材线虫的存活率下降较快，6d内降为0％。 35℃培养条件下与30℃培养条件下情况相似，但HSP90在高温条件下提高线虫存活率的效果更为明显。 以上结果表明松材线虫可以在较高气温条件下存活是由于其体内特异的基因表达决定的，热激培养后线虫基因表达与正常培养线虫基因表达明显不同;在受到热刺激时松材线虫HSP90基因发生表达，该基因的表达可以提高线虫在高温条件下的存活率;如果HSP90基因表达受到阻止，则线虫不能度过高温环境;如果HSP90基因过量表达，则线虫高温环境下存活率增高。 松材线虫HSP90基因克隆、表达和功能研究初步解决了高温应激环境下松材线虫基因表达情况和所表达的基因功能不清等问题，为松材线虫应激生理学以及研究松材线虫适生范围和风险分析提供了分子生物学理论基础。