研究背景：肝脏是人体内重要的实质性器官之一,是消化系统重要的组成部分。肝脏的功能极其复杂,参与食物的消化是肝脏作为消化腺的基本功能,肝脏分泌的胆汁是一种重要的消化液。除此之外,它还参与了糖类、脂类、蛋白质和维生素等营养物质的合成、转化、储备与分解等,此外,激素、代谢产物、药物等物质的转化和解毒也是在肝脏内进行的,肝脏是代谢最活跃的器官,肝脏还具有一定的免疫功能,在胚胎时期承担着机体的造血功能。由此可见,肝脏在人体发挥的重要作用是很多其他器官无法比拟的,各种病因导致的肝脏结构或功能上的损伤,势必会影响人的健康,甚至危及生命。常见的影响肝脏正常功能的因素有酗酒、感染病原体(病毒、寄生虫等)、自身免疫、高脂饮食、过度劳累等。就发达国家而言,肝病及肝脏相关的主要死因是酒精性肝病。我国是肝病的高发国,肝病以病毒性肝炎为主,其中乙型病毒性肝炎病又占绝大多数。2006年流行病学调查显示,我国乙肝表面抗原携带率在1-59岁一般人群中为7.18%,据此可以推算,我国有慢性乙肝感染者约有9300万人,其中约2000万人为慢性乙型肝炎患者。预防医学固然在降低乙肝感染率上发挥了至关重要的作用,但是对于已经慢性感染乙肝病毒的患者,尤其是慢性乙型肝炎的患者,如何进行乙肝的治疗仍然是医学界的一个难题。现代医学在乙肝的治疗方面积极探索,研制出了许多药物,包括保肝降酶的药物和抗病毒药物。抗病毒药物包括干扰素和核苷类抗病毒药物,这些药物在临床上广泛应用,取得了一定的效果,但是由于药物的副反应、病毒耐药、治疗费用和周期、有效率等因素也影响了其应用,开发更加有效、经济、安全的药物来治疗病毒性肝炎仍然在探索之中。病毒感染、酒精摄入、药物、化学毒物和自身免疫等因素均可以导致肝损伤,不同病因引起的肝损伤机制不尽相同,某种病因所导致的肝损伤机制也是由很多方面组成,涉及多个环节,不同机制之间又存在相互联系和影响,因此,肝损伤的机制十分复杂,目前尚未完全研究清楚。已知的肝损伤途径涉及改变质膜完整性、线粒体功能失调、内质网应激、氧化应激、肝细胞钙超载、免疫紊乱,炎症细胞因子释放、补体及免疫变态反应、细胞凋亡等。肝损伤是现代医学术语,中国医学中并无“肝损伤”的直接记载,根据肝损伤患者的症状、体征等临床表现,我们可以查到诸多类似的记载和论述。中医学中的“胁痛”、“黄疸”、“癥瘕积聚”、“鼓胀”等病症均与肝损伤有关。在治疗方面,审证求因、辨证论治和辨病施治相结合、局部与整体相结合是中医治病处方的基本原则。仅就病毒性肝炎来说,中医学认为病毒性肝炎的病因可分为内外两方面,内因是正气不足,外因是“湿热疫毒”侵犯机体,病位并不局限于肝,还涉及脾胃胆肾等脏腑。脾胃运化失司,肝胆疏泄失常,气滞、湿阻、热郁、血瘀,因而出现胁痛、黄疸、鼓胀、积聚等临床表现。因此在治疗上并不因为是“肝炎”而仅仅局限于治肝,湿热证在肝病中较为多见,清热利湿是肝病中常用的治法,但健脾疏肝、化瘀活血也均占有相当大的比重,久病及肾,肝肾同源,肝病过程中出现肾脏的病证则会从肾治疗。中医药治疗肝损伤或肝系病症,无论是从实验研究来看还是在临床实践中,凡应用得法,皆可取得不错的效果。栀子大黄汤出自汉代著名医家张仲景所著的《伤寒杂病论》一书,原文记载“酒黄疸,心中懊憹,或热痛,栀子大黄汤主之”,栀子大黄汤：栀子十四枚、大黄一两、枳实五枚、豉一升。栀子大黄汤具有泻热除烦之功,书中记载用它治疗酒疸,热重于湿者,酒疸为湿热蕴于中焦,上蒸于心,故心中懊憹；湿热阻滞,气机不利,不通则痛,故心中热痛。治用栀子大黄汤清心除烦,方中栀子、豆豉清热除烦,大黄、枳实除积泻热。后代医家将其用于治疗热重湿轻之肝胆疾患,如急性黄疸型肝炎,也用于无黄疸型肝炎。有研究显示栀子大黄汤对酒精性肝损伤有保护作用,其机制可能与减轻酒精导致的过氧化有关。对于其他类型的肝损伤的治疗并未见文献报道,其治疗肝损伤的机制并未见进一步的研究。研究目的：本研究拟建立四氯化碳急性肝损伤模型,研究研究栀子大黄汤对四氯化碳所致小鼠急性肝损伤的保护作用,并初步探究其保护作用的作用机制。通过血清ALT、AST改变以及肝组织病理评估肝损伤模型的建立与治疗效果,通过检测肝组织MDA和SOD水平和检测凋亡相关蛋白的表达探究其保护作用与抗氧化应激和抗凋亡之间的关系。为栀子大黄汤的临床应用提供实验依据。方法：1.栀子大黄汤的制备栀子大黄汤按栀子10 g,大黄5 g,枳实12 g,淡豆豉10g的组成,经水煎提取2次合并滤液,用旋转蒸发仪浓缩成低浓度(含生药量0.3 g/ml)、中浓度(含生药量0.6 g/ml)、高浓度(含生药量1.2 g/m1)的药液。2.动物分组和造模方法72只昆明小鼠随机分成6组,每组12只,分别为：正常对照组、模型组、联苯双酯(200mg/kg)组、栀子大黄汤低(6 g/kg)、中(12 g/kg)、高(24 g/kg)剂量组。各给药组每天按照相应浓度的药物灌胃一次,灌胃体积为20 ml/kg,正常组和模型组每天灌胃等体积的生理盐水,连续灌胃5天。除正常组外,各组最后一次灌胃一小时后,腹腔注射0.12%的CCl4溶液,剂量为10 ml/kg,正常组注射等体积的花生油,禁食,自由饮水。注射CCl4溶液16小时后,腹腔注射1%戊巴比妥钠50mg/kg麻醉小鼠,摘取眼球采血,全血室温放置1小时后,经离心机3000 r/min离心10 mmin后取上清备用。采血后处死小鼠,取肝部分左叶置于4%多聚甲醛溶液中固定,剩余肝左叶放入冻存管中于-80℃冰箱冻存备用。3.检测指标和检测方法3.1血清AST、ALT含量测定严格按照试剂盒说明书步骤进行。3.2肝组织病理学检测多聚甲醛固定后的肝组织经常规脱水、石蜡包埋、切片后,经HE染色,观察肝组织病理学改变。3.3肝组织MDA, SOD含量测定取一部分肝脏用生理盐水制成10%肝匀浆,按试剂盒说明书操作,检测肝组织中SOD的活力、MDA的含量。3.4肝组织目标蛋白的测定取一部分肝组织于烧杯中,用4℃PBS充分洗涤2次,迅速研碎组织,加入适量含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟(PMSF)的裂解液,在冰浴中匀浆,4℃静置30 mmin后,在4℃下12000 r/min,离心20min,将上清液移于另一管中待测。待测样品用BCA试剂测定蛋白含量后,取等量蛋白与含SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(2×)等体积混合,98℃煮沸10 mmin。经11% SDS-PAGE,转膜。含5%脱脂奶粉TBST封闭2小时,1：1000稀释一抗,室温摇荡孵育1小时,TBST洗3次,1：5000稀释辣根过氧化物酶标记的二抗,室温孵育1小时,TBST洗3次后,压片,显影,定影。4.统计学分析数据分析由SPSS13.0统计分析软件完成。结果以均数±标准差的形式(x±s)表示,多样本之间的均数比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),方差齐的资料组别之间的多重比较采用LSD检验,方差不齐的资料两两之间比较采用Dunnett’s T3检验。检验水准为α=0.05,当P<0.05认为差异有统计学意义。结果：栀子大黄汤对CCl4诱导急性肝损伤小鼠的ALT、AST影响与正常对照组相比较,模型组小鼠血清ALT、AST水平显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05),说明CCl4诱导急性肝损伤的模型建立成功；阳性对照药联苯双酯显著降低ALT水平(P<0.05),栀子大黄汤各组均能降低ALT水平(P<0.05),中、高剂量组能降低AST水平(P<0.05),栀子大黄汤三个剂量之间AST、ALT差异有显著性(P<0.05),高剂量组效果最好。与联苯双酯组比较,栀子大黄汤高剂量组ALT差异无显著性(P>0.05),AST差异有显著性(P<0.05),提示栀子大黄汤高剂量组降低ALT水平与联苯双酯无统计学差异,降低AST水平优于联苯双酯。栀子大黄汤具有保肝作用,能对抗CCl4导致小鼠急性肝损伤引起的血清ALT、AST水平升高。栀子大黄汤对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织病理变化的影响肝组织切片经HE染色后光镜下观察,正常对照组小鼠肝组织清晰,肝小叶结构完整,肝细胞呈放射状排列,汇管区清楚。模型组小鼠肝小叶中央静脉周围明显灶状坏死,肝细胞空泡样变,排列不规整,可见小灶状炎细胞浸润。与模型组相比,阳性对照组和给药组肝组织坏死区域减小,细胞肿胀、变性等病理性损伤均有不同程度减轻,以栀子大黄汤高剂量损伤程度最低。栀子大黄汤对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝组织MDA、SOD的影响与正常对照组相比较,模型组的小鼠肝组织的MDA含量显著升高(P<0.05),肝脏SOD活性显著降低(P<0.05)；与模型组相比较,阳性对照药联苯双酯和3个给药组均能显著地降低肝组织MDA含量以及升高SOD活性(P<0.05)。栀子大黄汤三个剂量MDA、SOD差异有显著性(P<0.05),高剂量组效果最好。与联苯双酯比较,栀子高剂量组MDA、SOD差异均无显著性(P>0.05),表明栀子大黄汤高剂量与联苯双酯效果无差异。表明栀子大黄汤具有抗氧化的作用,能对抗CCl4引起的小鼠肝组织MDA增加和SOD活性降低。栀子大黄汤对CCl4所致急性肝损伤小鼠肝脏中Bax、Bcl-2和Cleaved caspase-3表达的影响与正常对照组相比,模型组Bax和Cleaved caspase-3表达水平增加(P<0.05), Bcl-2表达水平减少(P<.05),说明CCl4引发了小鼠肝细胞凋亡。与模型组相比,阳性药和栀子大黄汤不同程度下调Bax和Cleaved caspase-3表达(P<0.05),上调Bcl-2表达(P<0.05)。栀子大黄汤中剂量和高剂量组下调Cleaved caspase-3强于联苯双酯(P<0.05)。结论：(1)采用0.12%的CCl4腹腔注射KM小鼠可以成功复制出急性肝损伤模型。在注射16小时采血和取肝组织能够能够观察到明显的血清ALT、AST变化和肝组织病理学改变。(2)栀子大黄汤对CCl4导致的急性肝损伤具有保护作用。(3)栀子大黄汤可能是通过减轻CCl4引起的氧化应激和抗肝细胞凋亡发挥其保肝作用。