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生物途径降解咖啡因是一种非常有希望应用于低咖啡因茶产品生产的新技术。本文在前期已筛选高耐咖啡因假单胞菌CT25的基础上,研究了该菌对不同甲基黄嘌呤类物质的代谢效率差异,初步明确了该菌的咖啡因代谢途径；同时开展了包含该菌基因组插入片段的重组工程菌耐咖啡因实验,筛选到了多个耐高浓度咖啡因重组子,并获得与代谢咖啡因相关的功能基因簇。主要研究结果如下：(1)在以2.5g/L咖啡因为唯一氮碳源的情况下,假单胞菌CT25能在58h内将培养基中咖啡因完全降解,平均降解速率约为0.043g/h,较多种已报道的耐咖啡因细菌高。在该条件下,培养28-57h时,是该菌的对数生长期。(2)该菌能利用黄嘌呤及多种甲基黄嘌呤类物质为唯一氮碳源而生存,但利用速率不同,表现为黄嘌呤>7-甲基黄嘌呤≈可可碱>咖啡因>茶碱>1-甲基黄嘌呤,其中利用黄嘌呤的速率约为可可碱(7-甲基黄嘌呤)、咖啡因和茶碱的2倍、3倍和8倍。说明N-1位脱甲基可能是该菌利用甲基黄嘌呤类生物碱的主要限速步骤。(3)该菌对不同甲基黄嘌呤类物质的降解产物差异明显,其利用咖啡因可能主要通过脱甲基途径,即咖啡因→可可碱(少量茶碱)→7-甲基黄嘌呤→黄嘌呤→尿酸；利用可可碱和7-甲基黄嘌呤也以脱甲基途径为主；降解1-甲基黄嘌呤以氧化途径为主,即1-甲基黄嘌呤→1-甲基尿酸；而降解茶碱可能存在3种途径,即N-脱甲基途径、直接氧化途径以及先N-3脱甲基再氧化途径。(4)该菌胞内酶和胞外酶对咖啡因的降解效率分别为44.34%和1.5%,说明该菌代谢甲基黄嘌呤类物质的酶类主要位于细菌细胞内。胞内酶对7-甲基黄嘌呤和可可碱的降解效率较高,均在65%左右,而对咖啡因和茶碱的降解效率相对较低,约45%。体外酶催化咖啡因代谢反应可归结为：咖啡因慢→可可碱(5)与蛋白胨氮源相比,咖啡因氮源培养条件下,假单胞菌中分子量分别为～28kDa、～32kDa、～35kDa、～40kDa和～65kDa蛋白表达量显著增加。(6)从5250个重组子中初筛出32个耐2.5g/L咖啡因阳性克隆,其中16个成功测序。耐咖啡因重组子插入序列涉及趋化响应、信号转导、转录调控、蛋白分泌、甲基转移、氧化还原、离子转运等多个代谢途径。11-14-ban-a11和15-18-ban-d13两个重组子能在10g/L咖啡因培养基中生长,其插入序列主要为编码咖啡因脱甲基降解途径相关酶类；15-18-ban-c14和87-90-ban-p22重组子能在7.5g/L咖啡因培养基中生长,其插入序列为编码参与氧化还原酶类。