Cyclophilin A (CypA)是亲环素家族中的主要成员,分子量约18kDa,在人体内多种组织和细胞中广泛表达。CypA最早被发现的功能是作为免疫抑制药物环孢菌素A(Cyclosporine A,CsA)在细胞内的主要受体,二者形成的复合物可以通过抑制钙调神经素的磷酸酶活性,进而阻止活化T细胞核因子(NF-ATs)向核内的移位以及下游相关基因的转录。CypA另一个重要的功能是具有肽基脯氨酰顺反异构酶(peptidyl-prolyl cis-tranisomerase,PPIase)活性,可以催化蛋白折叠和构象变化时肽基脯氨酰键的顺反异构化。CypA的顺反异构酶活性影响了细胞内蛋白质的转运、线粒体功能的维持、mRNA前体的加工、多蛋白复合体结构完整性的维持等多种重要的细胞生理过程。人体内CypA表达和功能的异常,与艾滋病、类风湿性关节炎、动脉粥样硬化等疾病的发生和进展有着紧密的联系。近几年来的研究还发现,CypA在肺癌、胰腺癌、子宫内膜癌等癌组织中的表达显著升高,CypA表达增高可能与癌细胞的增殖能力和抗凋亡能力提高有关。但是,CypA在肝癌中的表达和功能目前尚不清楚。本课题的研究目的是:(1)通过杂交瘤技术制备抗人CypA蛋白的单克隆抗体,为后续的研究提供必备的抗体工具;(2)阐明CypA蛋白在人正常肝组织和肝癌组织中的表达情况,以及CypA在肝癌的发生和发展过程中的功能和作用机制。本课题包含两部分内容(:1)利用高纯度的重组CypA蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA和细胞免疫荧光染色法筛选出特异性分泌抗人CypA单抗的杂交瘤细胞株,制备腹水后采用蛋白A吸附层析法纯化抗体;采用间接ELISA、蛋白免疫印记、细胞荧光、免疫组化等方法对单抗的特异性进行鉴定;最后对抗体可变区的基因进行克隆。(2)通过对肝癌和正常肝组织进行免疫组化染色,分析CypA在二者中的表达差异;明确CypA在肝癌细胞中是否存在分泌表达的形式,探讨可能的分泌形式对肝癌细胞的功能和作用机制。我们取得了以下结果:(1)制备了两株稳定分泌抗人CypA抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为C7B8F10和F6E4F8B2;两株杂交瘤制备的腹水中单抗的滴度均达到106,腹水中抗体纯化后纯度大于95.0%;两株抗体均为IgG1亚类,κ轻链;蛋白免疫印迹实验表明两个单抗均能与原核表达的CypA蛋白,以及肝癌细胞裂解液中的的CypA蛋白特异性地结合。(2)以C7B8F10进行免疫组化染色的结果表明,CypA在肝癌组织表达水平要显著高于正常肝组织;我们证实了培养的肝癌细胞可以分泌表达CypA,低氧的刺激会进一步增强这种分泌表达;重组CypA蛋白可以通过活化ERK1/2和p38MAPK信号途径促进肝癌细胞的增殖,这种促增殖作用不依赖于CypA的顺反异构酶活性。