论文部分内容阅读
肝素作为抗凝血药物被广泛应用于临床治疗,由于2008年美国发生了动物源肝素污染事件导致部分病人死亡,使酶法合成肝素成为热点。Heparosan是E.coli K5菌株荚膜多糖,可通过发酵制备获得,作为酶法合成肝素和硫酸乙酰肝素(Heparan sulfate,HS)的前体。迄今,酶法合成的heparosan硫酸化衍生物的抗凝血、抗病毒活性研究报道尚不多。本研究自行克隆制备了3-O硫酸转移酶(3-O-sulfotransferase-1,3OST-1),用于酶法3-O硫酸化修饰NSNAH(N-sulfo,N-acetyl heparosan),制备了NSNA3SHp(N-sulfo,N-acetyl,3-O-sulfoheparosan),并尝试进行了其抗乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)活性的评估试验。首先利用E.coli K5发酵制备获得的heparosan,进行N位碱法脱乙酰和三甲胺三氧化硫的硫酸化,成功制备了NSNAH,~1H-NMR谱中不同糖残基的相对积分值计算显示NSNAH的N位硫酸化程度为86.9%,可以作为进一步进行3-O位硫酸化修饰的底物。同时,从Wistar大鼠的大脑中成功克隆到了3OST-1基因,经测序和BLAST比对,该3OST-1基因片段与NCBI报道的褐家鼠来源的3OST-1同源性为99%。将其克隆到大肠杆菌表达载体pET-28a构建成pET-28a-3OST-1重组表达质粒,并在E.coli BL21(DE3)中成功诱导表达,得到的可溶性融合蛋白经UN-Scan-it gel 6.1软件分析,其分子量大小为39.49 kDa,为目标蛋白。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后的酶蛋白比酶活达110.20 U/mg。利用获得3OST-1酶进行NSNAH的3-O位硫酸化修饰获得了NSNA3SHp,对合成的产物进行~1H-NMR谱分析,结果显示硫酸基团成功转移到目标位点。通过其对HepG22.1.5细胞进行了抗乙肝病毒的实验,结果显示0.37μg/mL的NSNA3SHp对细胞没有毒性作用,而且具有一定的抗乙肝病毒的作用。其余浓度的NSNA3SHp由于对细胞有毒性,各项指标的检测结果尚不能用于准确确定其抗病毒作用。