目的：　　1.评价生物人工肝生物反应器中用海藻酸钠/壳聚糖微囊(AC微囊)的安全性和预期生物功能，为制定质量标准提供技术依据。　　2.评价用于生物人工肝支持系统中肝细胞的活性、合成和药物代谢功能;探索性考察Gal抗原缺失肝细胞与野生型动物肝细胞功能性基因表达的差异，为动物源性肝细胞用于生物人工肝的可能性评价提供基础数据。　　3.评价生物人工肝支持系统中血泵分离装置的血细胞损伤（溶血性能），建立连续流血泵评价溶血性试验的标准方法，为行业标准的制定提供技术依据。　　方法：　　1.根据李兰娟院士人工肝课题组提供的一步法制备AC微囊，并对AC微囊进行表面结构、密度、免疫阻隔、降解性、机械强度和物质通透性等进行物理表征，通过AC微囊的细胞毒性、溶血性和热原性进行评价，考察其生物相容性。　　2.采用HepG2细胞为实验对象，模拟其预期临床使用方式，用AC微囊包裹肝细胞，评价将用于生物人工肝支持系统中肝细胞活性、合成和药物代谢功能。采用Realtime-PCR技术对Gal抗原缺失动物肝细胞与野生型动物肝细胞功能性基因表达的差异进行评价。　　3.在一定循环管路及血泵工作条件下，采用氰化高铁血红蛋白法检测血浆中游离血红蛋白的量，考察血泵循环动力因素对红细胞潜在破坏作用即溶血性能评价。　　结果：　　1.制备AC微囊粒径为800～1000μm，呈球状、大小均一、SEM显示微囊有微孔洞;密度为（1.39±0.155）g/mL。在180 r/min振荡下24h后其完整率在95％以上;微囊通透性试验显示10min时人血清白蛋白释放率约为50％，90 min左右蛋白达到了平衡状态;免疫分子无法进入AC微囊中;模拟生物反应器经12h后，微囊形貌变化较小，介质pH值随着时间的增加而增加，特征峰的谱带强度明显减弱，说明静电相互作用减弱，分子键开始发生断裂，即作用3d的微囊发生一定程度的降解;MTT试验结果可以看出，用浸提液培养的细胞相对活性为97％左右，LDH试验中，微囊浸提液样品组的检测OD值为(0.381±0.035)，细胞毒性评价(MTT、LDH)的结果显示微囊浸提液与空白组相比细胞的相对活性没有显著性差异。微囊浸提液内毒素含量小于5U/mL;血液相容性评价直接法的溶血率为（1.36±0.211）％;浸提法的溶血率为（2.69±0.219）％。在8h内微囊残留DNA的量126 ng/mL，72 h后DNA的量约为572.122 ng/mL。　　2.包裹的肝细胞均匀分布在微囊内，培养48 h后细胞生长状态良好，死细胞数目极少;微囊化肝细胞在24h内氨代谢约为（312.43±88.16）ng/106细胞，24 h后每106个细胞的氨代谢能力逐渐增加;与未包裹的肝细胞相比其白蛋白和尿素合成量均有所提高，且随着时间递增微囊化培养的肝细胞CYP1A2活性提高约5倍，CYP3A4活性提高大于3倍;　　3.当iGB3S基因和GGTA1基因单敲或双敲时中肝药酶相关基因CYP1a1、CYP2b10、CYP3a和CYP4a14基因表达上调，促进药物代谢途径，糖基转移酶相关基因ST3Gal1、ST3Ga13、ST6Gal1和Neu5Ac基因的表达上调，说明敲除型小鼠中mRNA表达反应蛋白活性增加，仍有其他异源抗原的表达。　　4.建立血泵装置的溶血性评价方法，增加了氰化高铁血红蛋白检测法，血泵装置的溶血试验中各个时间点的修正溶血指数大于0.1，因此该血泵的泵速等因素可对红细胞造成明显的破坏作用;　　结论：　　1.采用一步法制备的AC微囊，具有良好的通透性和机械强度，具有一定的免疫隔离作用，在一定时间内无溶血性、无热原反应。　　2.对微囊化的细胞采用系统评价方法，包括细胞毒性评价、代谢活性和药物解毒功能评价。其结果显示，包裹的肝细胞均匀分布在微囊内，并且与未包裹的肝细胞相比其白蛋白、尿素合成量及P450活性均有所提高。　　3.Realtime-PCR结果表明Gal抗原缺失型动物肝细胞的肝药酶基因表达水平轻度上调，说明基因敲除动物肝细胞对肝药酶无负面影响，甚至基因表达水平轻度增高，可能有利于促进药物代谢;但也有部分基因表达下调，这也可能是在生物代谢途径中受到多种代谢通路的调控，还有待深入研究。　　4.在一定循环管路及血泵工作条件下，血泵循环动力因素对红细胞具有较大的影响，对血细胞的破坏程度高，说明对血泵进行溶血性评价至关重要;但临床上对泵速的要求不同，还有待深入研究。　　研究成果　　1.对生物人工肝中使用的微囊材料进行物理表征、生物学评价和体外细胞毒性评价，为建立生物人工肝支持系统中微囊化细胞培养的微囊材料质量标准和临床前评价行业标准提供实验数据，为风险评估及合理有效的监管提供科学依据。　　2.对微囊化细胞的生长、代谢活性及药物代谢的评价，建立了微囊化细胞的体外细胞效率评价方法。根据预期临床使用的细胞来源和种类的不同，对细胞的质量和效能进行相应的评价，为建立细胞质量标准和质控体系提供了理论技术支持。　　3.建立的生物人工肝支持系统血泵溶血性能评价方法为血泵溶血性评价的行业标准制定提供了依据。