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鸭肠炎病毒(Duck enteritis virus,DEV)又称鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV),为疱疹病毒科(Herpesviridae)α疱疹病毒亚科(Alphaherpesvirinae)马立克氏病病毒属(Mardivirus)成员,可引起禽类发生一种以血管损伤、体腔溢血、消化道炎症和实质器官退变为特征的急性接触性传染病,具有较高的发病率和死亡率,是目前威胁水禽养殖业健康发展的重要病原之一。micro RNA(mi RNA)是真核生物体内的一类具有调控功能、高度保守的非编码单链RNA分子,其长度约为18~25个核苷酸,可通过与靶基因m RNA互作而调节其表达,在细胞增殖、组织分化以及病毒复制等方面发挥重要作用。有资料研究表明,过表达DEV-mi RNA-D22-5P时,通过靶向结合DEV-ICP4基因m RNA而抑制DEV增殖,提示mi RNA在DEV增殖中发挥重要作用。为进一步明确mi RNA在DEV增殖中的调控作用,本研究通过构建DEV感染鸭肝脏mi RNA表达谱,筛选差异表达mi RNA并分析其对DEV增殖的影响,以期为阐明DEV致病机理提供新的线索和依据。主要研究内容如下:1.DEV感染鸭肝脏组织差异表达mi RNA分析(1)DEV人工感染鸭模型建立。选取30只临床健康鸭,随机分为试验组(鸭20只,腿部肌肉接种DEV病毒液0.2 m L)和对照组(鸭10只,接种生理盐水0.2 m L),于DEV接种后鸭群开始出现症状(66 h)、症状明显期(90 h)和濒死期(114 h)时,剖解观察试验鸭大体组织病变和采用PCR检测病毒核酸,结果:对照组鸭的临床症状、剖检病变、PCR核酸检测等均无异常。试验组鸭先表现为被毛粗乱、精神沉郁、食欲减退,后出现眼睑水肿、呼吸困难、拉黄绿色或褐色带血稀粪等症状;剖检可见血管受损、肠道出血和肝脏有坏死点等;对三个时段试验组鸭肝脏组织进行PCR检测,均能扩增出DEV特异性DNA片段(大小为133 bp)。上述表明本研究成功建立了DEV人工感染鸭模型。(2)DEV感染鸭肝脏mi RNA表达谱建立。采集上述试验组鸭66 h、90 h和114 h时的肝脏组织样本,通过mi RNA提取与高质量样本筛选、mi RNA序列比对与差异表达分析、KEGG与GO数据库分析等,结果:DEV感染66 h时鸭肝脏差异表达mi RNA有227个,主要富集在蛋白质消化吸收、ECM-受体相互作用和突触小泡循环等;感染90 h时差异表达mi RNA有225个,主要富集在松弛素信号通路、Wnt信号通路和胞吐作用等;感染114 h时差异表达mi RNA有231个,主要富集在蛋白质消化吸收、松弛素信号通路和局灶性粘连等;经KEGG和GO数据库分析发现,DEV感染鸭肝脏差异表达mi RNA涉及的免疫通路主要是JAK-STST信号通路,其中表达差异最为明显的是mi R-97和mi R-111。上述结果表明本研究成功建立了DEV感染鸭肝脏mi RNA表达谱。2.差异表达mi R-97和mi R-111与SOCS3基因靶标关系验证为探究mi R-97和mi R-111与宿主细胞SOCS3基因的靶标关系,本实验通过构建mi R-97和mi R-111 mimics载体后,分别与构建的SOCS3-3′UTR载体(含WT型和MUT型)共转染293t细胞,采用双荧光素酶报告基因技术进行验证其靶标关系,结果:mi R-97+SOCS3-3’UTR-WT组细胞荧光活性极显著低于mi RNA NC+SOCS3-3’UTR-WT组(P<0.01),且显著低于mi R-97+SOCS3-3’UTR-MUT组(P<0.05);同时mi R-111+SOCS3-3’UTR-WT组细胞荧光活性均极显著低于mi RNANC+SOCS3-3’UTR-WT组和mi R-111+SOCS3-3’UT R-MUT组(P<0.01),表明mi R-97和mi R-111均能靶向结合SOCS3-3’UTR。3.宿主细胞mi R-97和mi R-111对SOCS3表达及DEV复制的影响为验证mi R-97和mi R-111对SOCS3基因表达和DEV复制的影响,本实验取上述构建的mi R-97和mi R-111 mimics载体,分别转染已感染DEV的DEF细胞,收集不同时间段细胞样品,采用荧光定量PCR和ELISA方法分析过表达mi R-97和mi R-111后SOCS3基因和DEV-NP基因表达水平,结果:过表达mi R-97和mi R-111时,SOCS3在转录和蛋白水平上均呈极显著下降(P<0.01),同时DEV-NP基因相对表达量下降(P<0.05),表明mi R-97和mi R-111可能是通过抑制SOCS3基因表达来调控DEV复制。综上所诉,本研究成功建立了鸭DEV人工感染模型和DEV感染鸭肝脏mi RNA表达谱;DEV感染鸭肝脏差异表达mi RNA较多,且多与病毒增殖和免疫应答等信号通路相关,其中mi R-97和mi R-111可能是通过抑制SOCS3基因表达来调控DEV增殖,为进一步阐明DEV致病机理提供新思路。