背景:Pyle氏病（OMIM265900）是一种罕见的骨骼肌肉系统遗传病,该病的患者长骨干骺端肥大,松质骨骨量增加而皮质骨变薄,极易发生长骨骨折。我们课题组的前期研究首次揭示了Pyle氏病的病因是编码Sfrp4蛋白的基因突变导致患者体内Sfrp4蛋白的缺失。Sfrp4基因敲除的小鼠极大程度上模拟了Pyle氏病患者的骨骼肌肉系统改变:长骨干骺端肥大,松质骨增加,皮质骨变薄。同时,我们发现在Sfrp4基因敲除的小鼠长骨骨内膜上破骨细胞的数量大量增加。然而,Sfrp4蛋白的缺失是否可以直接影响破骨细胞的分化和功能,以及长骨骨内膜上增加的破骨细胞是否是导致Pyle氏病患者及Sfrp4基因敲除小鼠皮质骨变薄的原因仍未可知。目的:1、探索Sfrp4蛋白对破骨细胞的分化和功能的影响。2、探究Sfrp4蛋白影响破骨细胞的可能机制。3、探讨Sfrp4蛋白缺失导致Pyle氏病患者及Sfrp4基因敲除小鼠皮质骨变薄的可能原因。方法:1、从野生型和Sfrp4基因敲除的小鼠中分别提取骨髓巨噬细胞（BMMs）,在M-CSF和RANKL的刺激下诱导其向破骨细胞分化。用TRAP染色、RT-PCR检测破骨细胞分化相关基因以及骨吸收实验比较Sfrp4基因敲除的小鼠BMMs较野生型小鼠BMMs在破骨细胞分化和功能上的差异;用野生型小鼠提取BMMs,在诱导其向破骨细胞分化的过程中同时给予不同浓度的Sfrp4蛋白刺激（0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml）,用TRAP染色、RT-PCR检测破骨细胞分化相关基因等方法,了解Sfrp4蛋白对破骨细胞分化和功能的影响;分别提取野生型及Sfrp4基因敲除小鼠的颅骨成骨细胞（cOB）和BMMs,共培养,鉴别Sfrp4是通过自分泌效应还是旁分泌效应对破骨细胞的分化产生影响。2、分别提取野生型小鼠和Sfrp4基因敲除小鼠BMMs,诱导分化为破骨细胞,提取其蛋白和RNA,检测比较Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路及Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路相关蛋白、RNA的变化;提取Sfrp4基因敲除小鼠BMMs,在诱导分化为破骨细胞的过程中同时给予不同浓度的Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路抑制剂XAV939（0μM,1μM,5μM）及Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路抑制剂Sp600（0μM,2.5μM,5μM）处理,用Trap染色检测在Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路或者Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路被药物抑制的情况下,Sfrp4基因敲除所引起的BMMs破骨细胞分化和功能的改变能否得到缓解;提取Cre-ER^T2;Lrp5/6^fl/fl小鼠的BMMs,经Tamoxifen处理敲除BMMs上的Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路受体Lrp5和Lrp6,从而抑制BMMs中的Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路,诱导该BMMs向破骨细胞分化,同时给予Sfrp4（10μg/ml）刺激,并用Trap染色检测在Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路被抑制的情况下,Sfrp4蛋白是否仍然可以影响破骨细胞的分化和功能;提取Cre-ER^T2;Ror2^fl/fl小鼠的BMMs,经Tamoxifen处理敲除BMMs上的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路受体Ror2,从而抑制BMMs中的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路,诱导该BMMs向破骨细胞分化,同时给予Sfrp4（10μg/ml）刺激,并用Trap染色检测在Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路被抑制的情况下,Sfrp4蛋白是否仍然可以影响破骨细胞的分化和功能。3、构建Ctsk_creRor2^fl/fl转基因小鼠,在该小鼠破骨细胞中特异性的敲除Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路受体Ror2,并将该小鼠与Sfrp4基因敲除小鼠杂交,得到Ctsk_crere Ror2^fl/fSfrp4^+/-及Ror2^fl/fSfrp4^+/-转基因小鼠,用MicroCT和硬组织切片组织形态学分析比较其皮质骨厚度的变化及皮质骨骨代谢状态的变化,从而在在体状态下比较特异性的抑制破骨细胞中的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路能否缓解Sfrp4基因缺失所引起的小鼠皮质骨变薄。结果:1、Sfrp4基因敲除小鼠的BMMs在诱导分化为破骨细胞过程中较野生型小鼠的BMMs形成了更多的破骨细胞,更大的骨吸收面积,破骨细胞分化相关基因Nfatc1、C-fos、Rank、Dc-stamp、Trap和Cathepsin K的表达量也增高;Sfrp4蛋白呈浓度梯度依赖性抑制破骨细胞形成的数量,同时抑制破骨细胞分化相关基因Nfatc1、C-fos、Rank、Dc-stamp、Trap和Cathepsin K的表达;在cOB与BMMs的共培养中,“Sfrp4^-/-cOB+Wt BMMs”及“Wt cOB+Sfrp4^-/-BMMs”组形成的破骨细胞数量均多于“Wt cOB+Wt BMMs”组,而“Sfrp4^-/-cOB+Sfrp4^-/-BMMs”组形成的破骨细胞数量最多。2、Sfrp4^-/-破骨细胞较Wt破骨细胞Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路的None-P-β-Catenin蛋白及Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路的P-Jnk蛋白表达量均增高;当使用XAV939抑制Sfrp4^-/-BMMs中的Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路后,Sfrp4基因敲除所引起的破骨细胞形成增多并没有得到缓解;在使用Cre-ER^T2;Lrp5/6^fl/fl小鼠抑制BMMs中的Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路后,Sfrp4（10μg/ml）仍然可以发挥其抑制破骨细胞分化的功能;而当使用Sp600抑制Sfrp4^-/-BMMs中的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路后,Sfrp4基因敲除所引起的破骨细胞形成增多得到明显缓解;同时当使用Cre-ER^T2;Ror2^fl/fl小鼠抑制BMMs中的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路后,Sfrp4（10μg/ml）抑制破骨细胞分化的能力明显降低。3、Ctsk_creRor2^fl/fl转基因小鼠的皮质骨厚度较对照组Ror2^fl/fl转基因小鼠并没有统计学差异;Ctsk_creRor2^fl/fSfrp4^+/-转基因小鼠较Ror2^fl/fSfrp4^+/-转基因小鼠皮质骨厚度明显增加;同时组织形态学分析结果显示Ctsk_creRor2^fl/fSfrp4^+/-转基因小鼠较Ror2^fl/fSfrp4^+/-转基因小鼠长骨骨内膜破骨细胞数量明显减少,而骨内膜和骨外膜的骨形成指标无明显差异。结论:1、Sfrp4蛋白可以以自分泌和旁分泌的形式抑制破骨细胞的分化和功能。2、Sfrp4蛋白主要通过抑制破骨细胞中的Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路而非Wnt/β-Catenin经典Wnt信号通路来抑制破骨细胞的分化和功能。3、Sfrp4^-/-转基因小鼠长骨骨内膜上破骨细胞的数量增多是由于Sfrp4蛋白的缺失导致破骨细胞内Ror2/Jnk非经典Wnt信号通路激活而引起。增多的破骨细胞增强了长骨股内膜的骨吸收水平,使Sfrp4^-/-小鼠的长骨皮质骨变薄,脆性增加。这也揭示了Pyle氏病患者长骨皮质骨变薄,容易发生骨折的可能原因,为Pyle氏病和骨质疏松的治疗提供了新的思路。