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恶性肿瘤是导致人类死亡的一个主要原因。中国癌症死亡率已经超过了脑血管疾病,位居死亡原因之首。白血病,又名血癌,是一类造血干细胞异常的克隆性恶性疾病。化疗和药物治疗是目前治疗白血病的主要手段,而市场上能有效的治疗白血病的化学药物都有毒副作用。因此研究一种具有对机体毒副作用小,达到抑制和杀死恶性肿瘤细胞的目的药物成为抗肿瘤药研究的新的焦点。近几十年,大量具有活性的多糖从食用真菌,植物,藻类,酵母等中分离出来。研究表明活性多糖除了具有抗衰老、抗病毒、降血糖、刺激造血等作用外,还具有抗肿瘤与免疫调节活性,且对机体的毒副作用小。最近的研究又发现活性多糖能直接诱导癌细胞凋亡。通过诱导癌细胞凋亡治疗癌症己被证实为一种高效和重要的策略。因此,寻找一种能够诱导癌细胞凋亡的活性多糖,作为肿瘤治疗药物或者辅助治疗药物将非常有意义。本实验室前期工作已经完成拟康氏木霉胞外多糖EPS-1和EPS-2的分离纯化及其单糖组成等测定工作。EPS-1分子量为31930Da,单糖组成及摩尔比为鼠李糖:木糖:果糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖=16.2:14.4:1:25.8:23.6:48.1;EPS-2的相对分子量为18325Da,单糖组成为鼠李糖、葡萄糖和少量的半乳糖,摩尔比为Rha:Glc:Gal=5.6:2.7:1.0,初步分析表明这两种胞外多糖均为结构复杂的杂多糖。本课题组还研究发现EPS-1和EPS-2具有很强的免疫活性,而本文对EPS-1、EPS-2体外抑制肿瘤细胞的增殖活性和EPS-1诱导K562细胞凋亡的机制进行了研究。1.采用SRB法对拟康氏木霉胞外多糖体外EPS-1和EPS-2体外对肿瘤细胞增殖抑制作用进行评价。当用不同、浓度的EPS-1和EPS-2处理人白血病K562、HL-60和人胃癌SGC-790124h、48h和72h后发现,EPS-1和EPS-2都能够抑制它们的增殖,并且呈现时间和剂量依赖性,其中用浓度为1mg/mL的EPS-1处理人白血病K562细胞72h后,抑制率达到最大,为41%左右。2采用Hoechst33258染色方法观察拟康氏木霉胞外多糖处理肿瘤细胞后,细胞形态学的变化。分别加入含有不同浓度的胞外多糖培养48h,染色后在荧光显微镜下观察并拍照。对照组细胞形态一致,染色均匀,均呈现出微弱的蓝色荧光,而经过胞外多糖作用48h后,细胞形态发生改变,逐渐出现呈浓度致密的颗粒状强蓝荧光的细胞核,并且随着EPS-1浓度的增加,数量逐渐增多。结果提示胞外多糖是通过诱导癌细胞凋亡来抑制其增殖的。我们进一步使用Annexin V-FITC/PI染色方法进行确认。结果表明随着拟康氏木霉胞外多糖浓度的升高,发生早期凋亡的K562细胞越来越多,达到了20.5%,说明了磷脂酰丝氨酸由内膜翻转到了外膜,支持了上述实验结果。3.EPS-1诱导白血病K562细胞凋亡的机制研究。为了探究机理,我们分别采用了JC-1荧光探针来检测线粒体膜电位的变化,DCFH-DA荧光探针来检测胞内产生的ROS, Fluo-3/AM荧光探针来检测细胞内的钙离子浓度。结果发现EPS-1处理K562细胞后,线粒体膜电位下降,细胞内活性氧的产量增加,细胞内钙离子的浓度升高。这些结果表明线粒体途径参与了EPS-1诱导白血病K562细胞的凋亡4.为了进一步探究EPS-1诱导白血病K562细胞凋亡的机制,我们采用RT-PCR方法检测EPS-1处理白血病K562细胞后p53、Bcl-2、Bax、FasL和Fas的mRNA的表达量的变化。通过结果我们可以发现,Bcl-2的mRNA的表达量随着浓度的升高不断降低,而p53和Bax的mRNA的表达量刚好相反。Bcl-2与Bax的mRNA的表达量的比值不断降低。FasL和Fas的mRNA表达量不断增加,呈现剂量依赖性。结果再次证明了线粒体途径参与了EPS-1诱导白血病K562细胞凋亡,并且发现细胞膜受体途径也有参与。研究结果表明EPS-1能够通过Fas介导的细胞膜受体途径和线粒体途径诱导K562细胞发生凋亡。通过对EPS-1诱导白血病K562细胞凋亡机制的分析,为白血病的治疗提供新的线索,为将EPS-1开发成一种治疗白血病的化学辅助治疗药物提供数据支持和理论依据。