动脉粥样硬化（atherosclerosis,AS）是一种由于慢性炎症反应导致的血管壁增厚、管腔变窄的心血管疾病,在全球范围都有极高的发病率和致死率,对AS的防治研究具有积极意义。黄连是我国传统中药,其中的生物碱小檗碱、黄连碱、表小檗碱、药根碱和巴马汀是它的主要有效成分。现代医药研究不断发现它们除抗菌消炎传统功效外还具有降脂、抗心律失常、抗肿瘤等越来越多的药理作用。小檗碱抗AS作用的研究有少量报道,但对黄连中的其它生物碱是否有抗AS作用未见报道。本课题对此方面进行了研究,对比发现小檗碱和黄连碱抗AS作用最好,且小檗碱更优于黄连碱。但口服小檗碱生物利用度低,要达到相应的效果使用剂量大,通过对它改性以期提高它的抗AS作用效果。本实验结合前期研究结果,优化合成小檗碱烷基衍生物并应用于抗AS作用对比研究。最后基于分子对接技术对衍生物的抗AS作用机制做阐释。具体内容如下:1.黄连生物碱的制备及体内抗AS活性物质筛选利用黄连碱在冰醋酸中溶解度小的性质从10kg黄连中分离提纯获得16.52g黄连碱,提取率0.17%;利用聚酰胺的静电作用和反向层析作用,将极性不同的表小檗碱和药根碱分离纯化,10kg黄连中获得15.93g表小檗碱和8.74g药根碱。经测定黄连碱、表小檗碱和药根碱的纯度分别是96.9%、95.8%和98.1%。经过适应性喂养后70只C57BL/6J背景的apo E基因敲除(apo E^-/-)小鼠6周龄,雄性,体重18±2g随机分成7组:模型组（Model）、辛伐他汀组（Simvastatin）、小檗碱组（Berberine）、黄连碱组（Coptisine）、表小檗碱组（Epiberberine）、巴马汀组（Palmatine）、药根碱组（Jatrorrhizine）,给予西式饮食（78%基础饲料+21%脂肪+1.25%胆固醇）喂养。同时除模型组不给药,其它组每天根据不同组别灌胃药物,小檗碱、黄连碱、表小檗碱、巴马汀和药根碱组的每日给药量150 mg/kg;辛伐他汀每日给药量为3.0 mg/kg;模型组给予相同体积的0.2%tween-80生理盐水溶液。同时10只相同遗传背景下野生型C57BL/6小鼠作为正常对照组,每天灌胃相同体积的0.2%tween-80生理盐水溶液,给予普通饲料喂养。实验周期为12周,每两周记录一次体重,每天记录每组小鼠的平均进食量。实验结束时检测每组小鼠的血清脂代谢水平、体重、进食量、脏器重、肝脏油红O染色、胸主动脉整管和冰冻切片油红O染色,HE染色。结果发现模型组和正常对照组小鼠相比血脂水平显著升高,肝脏切片油红O染色呈现明显鲜红色,胸主动脉整管染色和冰冻切片油红O染色都表现出大量脂质堆积,HE染色表现出血管内皮增厚,大量泡沫细胞堆积、内皮细胞迁移、形成胆固醇结晶,表明成功建立AS模型。五种黄连生物碱单体都有不同程度降低AS小鼠血脂水平的能力,但在抗AS形成上表现有所不同。小檗碱在降低肝脏重量、减少肝脏脂质积累、血脂等指标优于黄连碱,且小檗碱在预防apo E^-/-小鼠AS斑块的形成中效果最佳,其次为黄连碱。表小檗碱、巴马汀和药根碱没有相应的预防AS的生理活性。2.小檗碱改性及体内抗AS作用效果比较由于口服小檗碱生物利用度低,要达到相应的效果使用剂量大,我们通过改性获得更好的生物利用度的小檗碱衍生物并用于抗AS作用研究。利用相应的格式试剂在四氢呋喃溶液中进行取代反应,又在乙醇溶液中进行溴代反应并通过AgCl沉淀获得8-烷基小檗碱粗品。产物在甲醇中重结晶三次,通过薄层鉴定获得高纯度的小檗碱衍生物,经核磁共振谱鉴定产物为8-辛基小檗碱（8-BBR-C8）和8-十六烷基小檗（8-BBR-C16）,纯度分别为95.3%和96.2%。适应性喂养后把48只C57BL/6J背景的apo E^-/-小鼠6周龄,雄性,体重18±2g随机分成4组,模型组、小檗碱组、8-BBR-C8和8-BBR-C16组,给予西式饮食喂养。每天根据不同组别灌胃药物,小檗碱每日给药量150 mg/kg;8-BBR-C8和8-BBR-C16组给药剂量为15 mg/kg,模型组给予相同体积的0.2%tween-80生理盐水溶液。同时12只相同遗传背景下野生型C57BL/6小鼠作为正常对照组,每天灌胃相同体积的0.2%tween-80生理盐水溶液,给予普通饲料喂养。实验周期12周,每两周记录一次体重,每天记录每组小鼠的平均进食量。实验结束时检测每组小鼠的血清脂代谢水平、体重、进食量、脏器重、肝脏油红O染色、胸主动脉取链接心脏的前1cm包埋后检测主动脉窦冰冻切片油红O染色。与正常对照组比,模型组的血脂水平显著升高、肝脏脂肪堆积显著、主动脉窦大量脂肪堆积,表明成功建立AS模型。小檗碱的给药剂量是衍生物的10倍,但小檗碱的衍生物在降低肝脏重量、减少肝脏脂质积累、预防apo E^-/-小鼠AS斑块的形成比小檗碱效果更好。相同给药剂量的小檗碱衍生物,8-BBR-C16抗AS效果更好。3.8-BBR-C16抗AS作用机制研究按照第一轮实验的方法收集各组血清和组织,选取正常对照组、AS模型组、小檗碱组和8-BBR-C16组进行机制研究。ELISA法检测血清每组小鼠的炎症指标IL-1β和TNF-α;生化试剂盒检测T-AOC、CAT、GSH、SOD和MDA水平,RT-PCR检测各组小鼠肝脏内抗炎和抗氧化关键基因NF-κBp65、i-NOS、ICAM-1、IL-6的表达;每组6只小鼠胸主动脉免疫组织化学法观察小鼠主动脉NF-κBp65、i-NOS和IL-6的蛋白表达情况;每组6只进行western blot检测各组小鼠主动脉NF-κBp65、i-NOS、ICAM-1和IL-6蛋白质表达和MAPK信号途径中的p38、ERK 1/2和JNK1/2磷酸化水平的表达。结果发现:（1）与模型组相比,小檗碱和8-BBR-C16都能有效降低AS小鼠血清IL-1β和TNF-α水平并升高抗氧化指标水平（P<0.01）,8-BBR-C16具有更好的抗炎抗氧化能力。（2）RT-PCR检测发现,模型组肝脏NF-κBp65、i-NOS、ICAM-1、IL-6基因水平比正常组显著升高,小檗碱和8-BBR-C16都能下调这些基因在肝脏中的表达水平,8-BBR-C16作用效果更好。（3）免疫组化发现,AS小鼠主动脉组织中NF-κBp65、i-NOS和IL-6阳性表达与正常对照组相比显著增加,小檗碱和8-BBR-C16能够显著减少这些蛋白的阳性表达,进一步说明药物可能通过抗氧化和抗炎协调发挥作用。（4）小檗碱和8-BBR-C16都能下调AS小鼠主动脉NF-κBp65、i-NOS、IL-6、ICAM-1蛋白质的表达并且能够下调AS小鼠主动脉p38和JNK1/2磷酸化水平。以上实验结果揭示小檗碱和8-BBR-C16的抗AS作用可能通过NF-κB/MAPK途径发挥抗氧化和抗炎作用。从抗AS相关靶点中选取了TNF?、iNOS、NF-?B和JNK四个靶点作为受体,分别与小檗碱和8-BBR-C16进行分子对接研究。对接结果表明,8-BBR-C16与所有受体结合总打分值均高于小檗碱与相应受体的结合,从空间构象上分析发现TNF?、i-NOS、NF-κB和JNK等靶点主要通过疏水相互作用或氢键与小分子配体发生作用,8-BBR-C16分子上的十六烷基有力地提高了其自身与靶点的结合稳定性,因此,8-BBR-C16都比小檗碱更易于与靶点形成稳定复合物。进一步更直观形象地阐释了8-BBR-C16抗AS作用好于小檗碱的分子机理。