旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞骨组织工程的研究目的微载体细胞培养技术是一种微载体与生物反应器结合的技术，现己广泛应用于组织工程领域。组织工程生物反应器系统能使细胞体外培养条件接近体内环境。旋转生物反应器(RCCS)可以使旋转过程中细胞所受到的流体剪切力达到最低，并用利于细胞的物质交换，故更适宜于贴壁细胞的生长。利用微球载体技术，在生物反应器内进行动物细胞大规模的培养，突破了传统意义细胞培养的瓶颈，为临床应用提供了可能。旋转生物反应器(RCCS)是1992年美国航空航天局(NASA)为模拟空间微重力效应而设计的一种生物反应器，是一个采用膜扩散式气体交换方式，水平旋转的细胞组织培养系统。具有模拟微重力、高密度培养组织细胞特性，既可用于微载体大规模细胞培养，也能在其内培养细胞与支架材料形成的三维空间复合物。我们利用此原理自行研制了RCCS，并在其内利用微载体技术进行了BMSCs的培养和快速扩增，将复合BMSCs的PHB作为骨组织工程支架修复兔下颌骨缺损。旨在探讨短期内快速培养，扩增骨种子细胞的方法，为骨组织工程的临床应用提供理论依据。实验研究包括三部分：第一部分：自制旋转生物反应器的研究旋转生物反应器包括储液罐、培养基充氧器、蠕动泵、反应器及控制台(培养系统如图6所示)，经连接组装后可置于培养箱内，使用前予以环氧乙烷熏蒸消毒。实验方法：对不同直径的颗粒(细胞种植在支架上的实体称为颗粒)在容器内的任何位置其表面受到的流体最大剪应力作检测。实验结果：本系统能够提供颗粒培养所需要的低剪应力特征的力学环境。第二部分：兔骨髓间充质干细胞分离方法的比较研究建立并优化骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)分离纯化的方法。实验方法：我们从兔的胫骨抽取骨髓，分别通过直接培养、经Ficoll—Hypaque(1.077g／ml)、Percol(1.073g／ml)两种分离介质进行分离后再培养的方法，收获所培养的细胞，然后利用抗CD44、HLA-DR抗体通过免疫组织化学方法测量MSCs的所占的比例。实验结果：直接培养、经Ficoll—Hypaque分离、Percol分离后再培养的细胞中骨髓间充质干细胞比例分别为67.3％、83.6％、93.4％。因此，采用Percol分离可以更好的提高BMSCs的纯度，提高BMSC的培养效率。第三部分：旋转生物反应器内微载体扩增骨髓间充质干细胞组织工程法修复兔下颌骨缺损实验方法：体外分离纯化BMSCs，在旋转生物反应器内利用微载体将其在短时间内快速扩增后接种于聚羟基丁酸酯(PHB)支架上，植入兔下颌骨缺损区，以单纯缺损、单纯基质材料作为对照。3、8、14、42、84天分别后处死各组家兔2只，对标本行组织学检查，骨形态发生蛋白(BMP)免疫组织化学检查、X线摄片。实验结果：实验组84天大部材料被骨性组织取代，修复骨缺损效率较对照组高。结论1、本实验中我们没有对BMSCs进行体外成骨诱导培养，而是直接将利用微载体细胞培养技术培养扩增BMSCs并与PHB复合，植入兔的下颌骨缺损区，并修复了骨缺损。2、自制的旋转生物反应器系统能够提供颗粒培养所需要的低剪应力特征的力学环境；在旋转生物反应器内应用微载体技术可成功地进行BMSCs的培养和快速扩增，能满足骨组织工程的需要：应用微载体细胞培养技术可使细胞扩增速度远高于普通细胞培养法的扩增速度，利用微载体细胞培养技术进行短时间扩增的BMSCs种植于PHB基质材料上，复合物在体内具有较高的修复骨缺损能力，缩短了成骨时间。BMSCs在动物体内可合成、分泌BMP，并具有成骨细胞活性。3、PHB可以作为一种组织工程材料修复骨缺损。材料中BMP阳性着色明显。而BMP正是使间充质干细胞向骨细胞分化的启动因子。利用组织工程技术可将内源性BMP局限于骨缺损区，提高了内源性BMP的浓度，并改善其分布。4、实验中经体外传代扩增的异体BMSCs与PHB复合后植入兔的下颌骨缺损区，并修复骨缺损。未见明显排斥免疫反应。