论文部分内容阅读
第一部分HA介导CPPs修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒的制备及其性能检测目的制备一种新型多功能超声分子探针----HA介导CPPs修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs),检测其粒径、电位、形态、载药量、包封率,探索其体外热致相变、声致相变的条件等。方法我们采用薄膜分散法、超声乳化法和静电吸附作用制备HA/CPPs-10-HCPT-NPs;通过Malvern激光粒度分析仪检测其粒径、电位;通过普通光镜、激光共聚焦显微镜和透射电子显微镜检测其形态及其分散性;通过高效液相色谱仪检测其载药量和包封率;在体外加热板加热条件下探索其热致相变条件;将HA/CPPs-10-HCPT-NPs加在琼脂糖凝胶模型里,通过低强度聚焦超声(LIFU)辐照探索其在体外声致相变的条件。结果成功制备出纳米粒HA/CPPs-10-HCPT-NPs,其悬液外观呈乳白色,平均粒径为(284.2±13.3)nm,平均电位为-(16.55±1.50)m V,普通光镜和激光共聚焦显微镜观察呈点状,分散性好,无成团聚集现象,透射电镜观察发现其呈圆球形,包封率和载药量分别是(48.10±3.13)%和(5.23±0.34)%,HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体外发生热致相变的温度约为45℃,经LIFU辐照,HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体外发生声致相变的条件为2.4 W/cm2 3min。结论成功制备了一种新型多功能超声分子探针----HA介导CPPs修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒(HA/CPPs-10-HCPT-NPs),其大小较均一,形态较规则,分散性好,在一定体外条件下(加热和超声辐照)具有良好的液气相变性能。第二部分HA介导CPPs修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒联合LIFU杀伤肝癌细胞的实验研究目的评估HA/CPPs-10-HCPT-NPs与LIFU辐照联合对肝癌细胞SMMC-7721的杀伤效果,为后续进一步开展体内动物实验奠定基础。方法通过western blotting检测SMMC-7721细胞膜CD44的表达情况;为观察纳米粒HA/CPPs-10-HCPT-NPs与SMMC-7721的靶向结合能力,我们将SMMC-7721细胞分为靶向组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs组),非靶向组(CPPs-10-HCPT-NPs组),干预组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs+HAase组),激光共聚焦显微镜观察Di I标记的各种纳米粒与SMMC-7721的靶向结合情况;为评估HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体外的穿膜能力,我们通过培养3D多细胞肿瘤球(3D MCTS)模拟体内实体瘤的肿瘤微环境,并将3D MCTS分为穿膜肽组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs组)和非穿膜肽组(HA/10-HCPT-NPs组),通过激光共聚焦显微镜分别观察Di I标记的两组纳米粒穿透SMMC-7721的3D MCTS的能力;在抗增殖实验中,将种植在96孔板里的SMMC-7721细胞分为如下12组:对照组,单纯10-HCPT组,HA/CPPs-10-HCPT-NPs组,CPPs-10-HCPT-NPs组,HA/10-HCPT-NPs组,10-HCPT-NPs组,LIFU组,10-HCPT+LIFU组,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组,CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组,HA/10-HCPT-NPs+LIFU组,10-HCPT-NPs+LIFU组,通过CCK-8法检测各组处理因素对肝癌细胞SMMC-7721存活的影响;在细胞凋亡实验中,将SMMC-7721细胞按照抗增殖实验的处理和分组,采用流式细胞术检测各组处理因素对肝癌细胞SMMC-7721凋亡的影响。结果肝癌细胞SMMC-7721高表达CD44;在靶向组中,可见大量的HA/CPPs-10-HCPT-NPs与SMMC-7721细胞紧密结合,并有大量的纳米粒进入细胞内,而在非靶向组,几乎看不到CPPs-10-HCPT-NPs与细胞结合,在干预组,也几乎看不到或仅可见少量纳米粒与SMMC-7721结合;在3D MCTS模型中,在穿膜肽组可见大量的HA/CPPs-10-HCPT-NPs聚集在细胞球周围,而在非穿膜肽组,则仅见少量的纳米粒附着在细胞球体上,通过穿透深度检测穿膜肽组纳米粒的穿透深度为27.14μm,非穿膜肽组为9.83μm,前者是后者的2.76倍;通过CCK-8法检测发现单纯10-HCPT组较各纳米粒组的细胞存活率低,靶向组较非靶向组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs组vs CPPs-10-HCPT-NPs组,HA/10-HCPT-NPs组vs 10-HCPT-NPs组)低,在所有分组肝癌细胞中,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组SMMC-7721细胞的存活率最低;最后通过流式细胞术检测发现在所有分组中,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组SMMC-7721细胞的凋亡率最高。结论HA/CPPs-10-HCPT-NPs在HA的引导下能特异靶向结合到高表达CD44的SMMC-7721细胞上,并在CPPs的介导下能穿透进入更深的3D MCTS内,穿透细胞膜进入细胞内,靶向更多更深层次的肝癌细胞,从而实现HA/CPPs-10-HCPT-NPs精准高效靶向肝癌细胞的目的,在联合LIFU辐照条件下,HA/CPPs-10-HCPT-NPs对肝癌SMMC-7721细胞有更显著的杀伤作用。第三部分HA介导CPPs修饰的载10-HCPT的相变脂质纳米粒联合LIFU诊断与治疗肝癌的实验研究目的评估HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU对裸鼠肝癌皮下移植瘤的诊断治疗效果。方法为了解HA/CPPs-10-HCPT-NPs在裸鼠体内靶向肝癌皮下移植瘤的能力,将荷瘤裸鼠分为靶向组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs组)和非靶向组(CPPs-10-HCPT-NPs组),将Di R标记的上述两种纳米粒分别经裸鼠尾静脉注入裸鼠体内,采用小动物活体荧光成像仪分别在注入后4h,24h采集活体荧光信号,并在24h后处死裸鼠,取下肝癌皮下移植瘤和心、肝、脾、肺、肾等主要器官进行荧光成像,分析两组荧光强度的变化情况;为进一步证实HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体内的靶向性能,将Di I标记的HA/CPPs-10-HCPT-NPs和CPPs-10-HCPT-NPs纳米粒分别注入荷瘤裸鼠体内,1h后处死裸鼠,取下肝癌皮下移植瘤进行快速冰冻切片,在激光共聚焦显微镜下观察两组纳米粒在肿瘤内的分布情况;为了进一步验证HA/CPPs-10-HCPT-NPs在体内的靶向能力和增强超声显影的效果,将荷瘤裸鼠分为HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组,CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组,HA/CPPs-10-HCPT-NPs组,前两组在相应纳米粒注入体内后1h开始LIFU辐照肿瘤部位,第三组不进行LIFU辐照,然后用超声诊断仪探查LIFU辐照前后肿瘤部位的超声声像图,并用DFY分析软件对声像图感兴趣区的回声强度进行分析;为了评价HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照对肝癌裸鼠皮下移植瘤治疗效果,将荷瘤裸鼠分为12组,分别为对照组,10-HCPT纯药组,有肽有靶NPs组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs组),有肽无靶NPs组(CPPs-10-HCPT-NPs组),无肽有靶NPs组(HA/10-HCPT-NPs组),无肽无靶NPs组(10-HCPT-NPs组),LIFU组,10-HCPT+LIFU组,有肽有靶NPs+LIFU组(HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组),有肽无靶NPs+LIFU组(CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU组),无肽有靶NPs+LIFU组(HA/10-HCPT-NPs+LIFU组),无肽无靶NPs+LIFU组(10-HCPT-NPs+LIFU组)。对照组和单纯LIFU辐照组经尾静脉注入生理盐水,其余各组分别注入相同剂量10-HCPT的相应纯药和纳米粒,注射1h后采用LIFU(3.2 W/cm2,占空比50%,5min,脉冲模式)对肿瘤部位进行辐照,从成瘤第20天开始至第30天,每两天进行一次治疗,第31天时处死各组裸鼠,分离出瘤子进行称重,用游标卡尺测量最大长径和最大宽径,并计算抑瘤率和肿瘤体积,将肿瘤组织用4%多聚甲醛固定后送HE、PCNA和TUNEL染色,计算各组肿瘤的增殖指数(PI)和凋亡指数(AI)。结果小动物活体荧光成像仪观察发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs组在4h和24h肿瘤部位均显示明显的荧光信号,而在CPPs-10-HCPT-NPs组,荷瘤裸鼠肿瘤部位未见明显的荧光信号,24h处死裸鼠后离体肿瘤进行荧光成像,也可见HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的肿瘤组织荧光信号强于CPPs-10-HCPT-NPs组,定量分析也验证了前者的荧光强度也显著高于后者,差异具有显著统计学意义(P<0.001);激光共聚焦显微镜观察肿瘤组织快速冰冻切片发现在HA/CPPs-10-HCPT-NPs组的肿瘤组织内散在分布点状红色荧光信号,而在CPPs-10-HCPT-NPs组的肿瘤组织切片里几乎未见到纳米粒的红色荧光信号;在体内声致相变实验中,我们发现LIFU辐照前的各组肿瘤部位的声像图均为低回声,HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组可见LIFU聚焦区域的肿瘤声像图呈现明显的强回声,而在CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的肿瘤声像图未见明显回声增强信号,另外在无LIFU辐照的HA/CPPs-10-HCPT-NPs组同样未发现回声增强信号,用DFY分析软件定量分析HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组在LIFU辐照前后的回声强度增加显著高于其余两组,差异具有统计学意义(P<0.05);在评估HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照对肝癌裸鼠皮下移植瘤的治疗效果实验中,发现HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的抑瘤率最高,体积最小,HE染色发现在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的肿瘤坏死最明显,PCNA染色发现在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的肿瘤组织PI最低,TUNEL染色发现在HA/CPPs-10-HCPT-NPs+LIFU辐照组的肿瘤组织的AI值最高。结论HA/CPPs-10-HCPT-NPs可特异靶向荷肝癌裸鼠皮下移植瘤,并穿过细胞外基质和细胞膜屏障实现更深、更多肿瘤细胞的靶向,HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照可明显增强肿瘤部位的超声显像,并显著抑制肝癌生长,因此HA/CPPs-10-HCPT-NPs联合LIFU辐照有望成为一种精准诊疗肝癌的新策略。