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5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)由5-甲基胞嘧啶(5mC)经Ten eleventanslocation(Tet)双加氧酶催化氧化形成。作为一种重要的表观遗传修饰，5hmC在基因组中相对含量低，但其在多种生物过程发挥重要作用，如基因表达、细胞分化、胚胎发育及神经元功能等。此外，5hmC的修饰水平与癌症密切相关，多项研究显示癌症的发生伴随着5hmC整体水平的降低。因此，深入研究5hmC的生物学功能至关重要，而测定5hmC在基因组中的含量与分布是进一步探究5hmC的生物功能的基础。 发展简单有效的方法测定5hmC是本课题的主要工作。据此，本研究使用恒温扩增酶phi29 DNA聚合酶，将糖基化介导的滚环扩增(RCA)反应与实时定量PCR(qPCR)相结合，实现特定序列中5hmC的定量检测。 首先制备了含有不同类型胞嘧啶的双链DNA探针（C-/5mC-/5hmC-/5ghmC-dsDNA probe）及不同5ghrC修饰密度的系列探针(5ghmC probe D-1，D-2，D-3，D-4，D-5)。 RCA实时分析显示，5ghmC修饰使RCA反应的产物产量下降，即5ghmC修饰可阻碍phi29 DNA扩增酶的扩增效率。分别以各RCA反应的产物为模板进行qPCR扩增，得到各个反应的Ct值。以C相关的qPCR反应的Ct值为基准值，计算各个修饰参与qPCR反应的△Ct值。结果显示，C相关qPCR反应的△Ct值（-0.00±0.09）与5mC（-0.06±0.08）及5hmC（-0.02±0.03）相关的qPCR反应的△Ct值之间无统计学差异，但与5ghmC相关qPCR的△Ct值（1.59±0.03）存在显著性差异。5ghmC相关qPCR的Ct值的特异性增加使得该方法可检测5hmC修饰的存在。 使用5gumC密度不同的探针进行RCA-qPCR反应，结果显示5ghmC密度与△Ct值线性关系良好:△Ct=0.0209*[5ghmC/1000 C]+0.111，R2=0.97，且当模板中5ghmC修饰密度低至7.3±0.4/1000 C时，该方法依旧能够检测到5ghmC。 进一步将5ghmC-dsDNA probe与C-dsDNA probe按不同比例进行混合作为RCA-qPCR反应的模板。结果表明随着模板中5ghmC-dsDNA probe比例的增加，Ct值逐渐增大，且反应中5ghmC修饰的含量与相应qPCR的△Ct值呈线性相关(△Ct=0.0204*[5ghmC/1000C]+0.104，R2=0.98)。比例及密度实验得到的线性方程的相似性初步证明了qPCR反应△Ct值的主要决定因素为5ghmC修饰密度。