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第一部分:铁死亡参与钙化性主动脉瓣疾病的发病过程目的:探讨铁死亡现象是否参与人钙化性主动脉瓣疾病(CAVD)和主动脉瓣膜间质细胞(human valve interstitial cells,h VICs)的成骨样分化。方法:收集临床上的非CAVD(n=8)及CAVD(n=8)患者的人主动脉瓣标本。采用普鲁士蓝染色检测非CAVD组(n=3)和CAVD组(n=3)瓣膜组织中铁离子含量。采用透射电镜观察非CAVD组(n=1)和CAVD组(n=1)中线粒体形态;采用I型胶原酶消化瓣膜后分离h VICs,用免疫荧光染色进行表型鉴定;采用成骨诱导培养基处理h VICs,RT-PCR检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、Runt相关转录因子(Runt related transcription factor 2,Runx2)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein2,BMP2)的表达。采用白介素1-beta处理h VICs,对对照组(n=3)及实验组进行转录组测序,使用RT-PCR检测铁死亡相关分子表达情况。采用免疫荧光及检测非CAVD组(n=3)和CAVD组(n=3)瓣膜组织中酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(acyl-Co A synthetase long chain family member 4,ACSL4)及谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)和活性氧水平。采用Western blot检测非CAVD组(n=6)和CAVD组(n=6)瓣膜组织中ACSL4及GPX4表达水平。结果:与非CAVD组相比,CVAD组中ACSL4及活性氧明显升高,GPX4明显降低,线粒体结构出现明显异常。转录组分析提示变化明显的差异基因可以富集到铁死亡通路上。原代h VICs分离成功,α-SMA和vimentin呈阳性,CD31呈阴性。成骨诱导培养基可以使BMP4、RUNX2、ACSL4表达明显增多,GPX4表达明显降低。结论:铁死亡参与钙化性主动脉瓣疾病的发病过程。第二部分:铁死亡参与人主动脉瓣间质细胞成骨样分化的机制研究目的:探究铁死亡现象参与人主动脉瓣膜间质细胞(human valve interstitial cells,VICs)成骨样分化的作用及机制,为钙化性主动脉瓣疾病(calcific aortic valve disease,CAVD)的治疗提供依据。方法:采用脂质过氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)试剂盒检测成骨诱导前后脂质过氧化情况,使用铁死亡抑制剂铁抑素-1(Ferrostatin-1,Fer-1)及铁螯合剂去铁胺(Deferoxamine,DFO)处理后,茜素红S染色法检测h VICs成骨分化能力。对h VICs进行成骨样分化诱导并加入铁死亡抑制剂FER-1及铁螯合剂DFO干预后,使用二价铁离子探针Fe Rho、脂质过氧化探针C11-BODIPY 581/591、活性氧探针DCFH-DA、线粒体探针Mitotraker、线粒体膜电位探针JC-1进行活细胞染色评估铁死亡相关表型的变化。使用生物信息学方法分析GEO数据库上公开的人主动脉瓣转录组数据,采用透射电镜观察非CAVD组(n=1)和CAVD组(n=1)的自噬水平,采用LC3-GFP转染和Lysotraker探针活细胞染色观察h VICs成骨样诱导前后的自噬水平,Western blot检测h VICs在成骨诱导下铁代谢及铁自噬相关分子铁蛋白轻链(ferrtin light chain,FTL)、铁蛋白重链(ferrtin heavy chain,FTH)、核受体共激活因子4(nuclear receptor coactivator 4,NCOA4)的变化。使用二价铁离子探针Fe Rho、脂质过氧化探针C11-BODIPY 581/591、活性氧探针DHCHF、线粒体探针Mitotraker、线粒体膜电位探针JC-1检测自噬抑制剂3-MA在成骨诱导下处理h VICs后铁死亡相关表型的变化。结果:进行成骨诱导培养基干预后,h VICs的脂质过氧化产物MDA明显增多。使用DFO及FER-1干预可以逆转成骨诱导培养基所致h VICs的钙化。使用FER-1干预可以逆转h VICs中成骨诱导培养基所致的活性氧增加、脂质过氧化产物的堆积、线粒体质量的下降和线粒体膜电位的降低。GEO数据库上的转录组数据提示自噬相关信号通路在CAVD病变中出现激活。CAVD标本和成骨诱导培养基干预后的h VICs中可以观察到自噬的产生和铁代谢通路的激活。使用自噬抑制剂3-MA干预可以逆转h VICs中成骨诱导培养基所致的二价铁离子的增多、活性氧增加、脂质过氧化产物的堆积、线粒体质量的下降和线粒体膜电位的降低。结论:铁死亡可能通过导致线粒体功能失调促进h VICs的成骨样分化和瓣膜钙化,且可能由自噬诱发。