目的:在法医实践中经常遇到受害人在遭受限制人身自由如持续捆绑、束缚后出现不同程度精神损伤的案件。但由于损伤机制不明确,对这类事实的认定尚缺少系统合理的科学解释,因此难以出具客观公正的鉴定意见。此类案件的共同特点是当事人经受束缚、捆绑后常发生强烈的精神心理应激反应。深入探讨过度应激引发机体精神损伤的机制对于揭示此类非直接暴力性损伤引起的精神损伤甚至死亡的机制具有重要意义。本实验室前期工作证实,应激可以引起大鼠心、肾、杏仁核、海马等多个组织器官损伤,提示应激对机体的损伤作用不容忽视。应激主要的神经内分泌反应是下丘脑-垂体-肾上腺皮质轴强烈兴奋,肾上腺糖皮质激素（Glucocorticoid,GC）的合成和分泌增加。适度应激时GC在维持机体内稳态平衡中发挥调节作用,但过度应激时GC水平异常升高则会对机体产生不利影响。近年来研究证实GC参与了应激引起的神经炎症反应,应激神经炎症反应成为抑郁症、创伤后应激障碍等疾病的主要发病机制之一。小胶质细胞（Microglia,MG）是中枢神经系统主要的免疫细胞,是介导神经炎症反应的关键。GC主要包括皮质醇和皮质酮,啮齿类动物以皮质酮为主。有学者证实用皮质酮（Corticosterone,CORT）作用小鼠来源的MG可以引起促炎因子分泌,提示GC激活MG可能在应激所致神经炎症反应中发挥重要作用,但其分子机制尚不清楚。损伤相关分子模式是组织或细胞受到损伤、缺氧、应激等因素刺激后释放到细胞间隙或血液循环中的一类内源性分子,即内源性危险信号,在神经炎症反应中发挥关键作用,其代表性物质高迁移率族蛋白B1（High mobility group box 1 protein,HMGB1）是神经炎症反应的重要启动者。在生理条件下,HMGB1主要在细胞核内参与各种生物学过程。一旦受到有害因素刺激,HMGB1表达水平增加,由细胞核转移至细胞质,进而分泌到细胞外,识别细胞表面受体,启动炎症相关的信号转导通路。课题组前期研究发现束缚应激大鼠杏仁核小胶质细胞存在HMGB1转位现象,表明HMGB1可能参与了应激所致的神经炎症反应。那么CORT对HMGB1的生成有何调节作用?在CORT活化MG的过程中,HMGB1发挥何种作用?均未见文献报道。基于以上研究背景,本研究拟在细胞水平采用CORT活化小胶质细胞BV2细胞,探讨HMGB1在CORT活化MG中的作用,为阐明应激所致神经炎症反应的机制提供实验依据。方法:1.体外培养小鼠BV2细胞,细胞免疫荧光染色方法检测BV2细胞IBA1（MG的标记物）表达情况。该细胞系基本具备原代培养的小胶质细胞的形态学、表型及各项功能特点,被作为研究脑内炎症反应最常用的细胞模型。2.采用不同浓度10-8M、10-7M、10-6M、10-5M CORT作用BV2细胞,通过ELISA法检测IL-1β表达以确定后续实验中CORT的浓度。3.实验分为6组:Control组、CORT组、CORT+RU486（糖皮质激素受体抑制剂）组、RU486组、CORT+GLY（HMGB1抑制剂）组、GLY组。4.Western blot方法检测BV2细胞炎症因子IL-1β、TNFα及损伤相关分子模式HMGB1的表达。5.细胞免疫荧光染色方法检测BV2细胞炎症因子IL-1β、TNFα及损伤相关分子模式HMGB1的表达。6.采用SPSS25.0软件进行统计学分析,所有数据以均数±标准误（Mean±SEM）表示,各组均数的比较行单因素方差分析（ANOVA）,并采用最小显著差法（Least significant difference,LSD）进行两两比较,统计学结果以P<0.05为有统计学差异。结果:1.细胞免疫荧光染色结果显示BV2细胞均表达IBA1,确定为小胶质细胞系,可以用于后续实验。2.ELISA结果显示与Control组相比,10-7M、10-6M、10-5M的CORT作用于BV2细胞24h后,BV2细胞IL-1β释放明显升高（P<0.05）,且呈浓度依赖性;而10-8M的CORT释放的IL-1β与Control组相比无显著性差异。因此选择10-5M CORT进行后续实验。3.IL-1β表达水平的变化免疫荧光染色和Western blot结果显示,与对照组相比,CORT组IL-1β表达水平明显增加,而与CORT组相比,CORT+RU486组IL-1β表达水平明显降低,提示CORT可通过受体促进小胶质细胞分泌IL-1β。单纯RU486组与对照组比较,IL-1β表达水平无明显变化。与CORT组相比,CORT+GLY组IL-1β表达水平明显降低,提示HMGB1在CORT促进小胶质细胞分泌IL-1β的过程中发挥了重要作用。单纯GLY组与对照组比较,IL-1β表达水平无明显变化。4.TNF-α表达水平的变化免疫荧光染色和Western blot结果显示,与对照组相比,CORT组TNF-α表达水平明显增加,而与CORT组相比,CORT+RU486组TNF-α表达水平明显降低,提示CORT可通过受体促进小胶质细胞分泌TNF-α。单纯RU486组与对照组比较,TNF-α表达水平无明显变化。与CORT组相比,CORT+GLY组TNF-α表达水平明显降低,提示HMGB1在CORT促进小胶质细胞分泌TNF-α的过程中发挥了重要作用。单纯GLY组与对照组比较,TNF-α表达水平无明显变化。5.HMGB1表达水平的变化Western blot结果显示与对照组相比,CORT组HMGB1表达水平明显增加,而与CORT组相比,CORT+RU486组HMGB1表达水平明显降低,提示CORT可通过受体促进小胶质细胞分泌HMGB1。单纯RU486组与对照组比较,HMGB1表达水平无明显变化。与CORT组相比,CORT+GLY组HMGB1表达水平明显降低,表明给予HMGB1抑制剂可明显抑制CORT诱导的HMGB1表达。单纯GLY组与对照组比较,HMGB1表达水平无明显变化。6.HMGB1表达位置的变化免疫荧光染色结果显示,对照组HMGB1仅表达在BV2细胞胞核,CORT组HMGB1在胞核、胞质均有表达且胞核内表达水平增高,结合Western blot结果表明CORT可诱导HMGB1表达水平增高且发生了转位现象,部分胞核内的HMGB1转位到胞质发挥作用;而与CORT组相比,CORT+RU486组HMGB1仅表达在胞核,进一步验证CORT可促进小胶质细胞HMGB1分泌及转位。单纯RU486组与对照组比较,HMGB1表达无明显变化。与CORT组相比,CORT+GLY组HMGB1仅表达在胞核,且表达水平也呈下降趋势。单纯GLY组与对照组比较,HMGB1表达无明显变化。结论:作为损伤相关分子模式,HMGB1在皮质酮诱导小胶质细胞分泌炎症因子的过程中发挥重要作用。